本实验室现正式对外提供石蜡切片，冰冻切片及细胞免疫荧光技术！关于免疫荧光中如果要封闭抗原是用BSA吗 多少浓度？在孵育一抗前，还是之后的问题，再次跟大家详解一下：BSA可以用来封闭，网上查到的浓度0．5％到2％都有，1％比较常见。
   孵育一抗之前要加，封闭孵育时间过后，加一抗之前不要洗掉，只移除多余液体即可．之后不需要再封闭，但是一抗和二抗都应该用含有BSA的缓冲液来稀释。有些人还加tween来减少非特异性结合。
   封闭抗原也可以使用二抗抗体所属动物种类的血清．没有统一固定的浓度要看情况。用试剂盒则有自带的封闭试剂，效果更稳定有保障。
  免疫染色实验一个重要特点就是最佳条件都是试出来的，每换一个抗体条件都可能需要调整。所以最好的办法是用生产商测试过的实验方法。

免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）
免疫组化步骤：
1.将脑片放到，6 孔板（或12 孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min
（如果是从切片保护液取出，则要用PBS 洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差
别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；
2.吸去双氧水，PBS 洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要
碰到脑片；
3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑
片一张需50 微升一抗稀释液，小鼠脑片为30 微升；注意不要让液体流到边上；
如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；
4.然后，4℃，过夜（18h 或者24h），不建议使用37℃；
5.然后，PBS 洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。
6.DAB 配方为：10mg DAB 固体加到20ml 0.01MPBS，临用时加100-200 微升
30%双氧水，注意避光。
7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。一般3 分钟显色就比较
明显，如果20 分钟仍未显色，则看下面的参考。
8.然后PBS 洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。
9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，
二甲苯2min，二甲苯3-5min。如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水
1min。
免疫荧光步骤及注意事项：
1， 将脑片放到6 空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保
护液取出，则要用PBS 洗一遍）
2， 吸去山羊血清，PBS 洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意
不要碰到脑片；
3， 然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS 稀释后的一抗，一般，
大鼠脑片一张需50 微升一抗稀释液，小鼠脑片为30 微升；注意不要让液体
流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；
4， 4℃，过夜（18h 或者24h），不建议使用37℃，如果荧光亮度不强，可以延
长孵育时间到48 或72 小时；
5， 然后，PBS 洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2
小时。注意避光操作。
6， 0.01M PBS 洗两遍，转移到载玻片上，避光自然晾干；
7， 滴加防淬灭剂后，盖上盖玻片镜下观察。
常见问题：
1， 荧光太暗：可能蛋白表达少；可能一抗孵育时间短；二抗孵育时间短；清洗
次数过多；溶液pH 不合适；荧光萃灭；一抗浓度过低或过高；二抗浓度过
低或过高；激发波长不在抗体适用波段。
2， 背景荧光太深：一抗浓度过高，清洗不彻底；二抗浓度过高，清洗不彻底；
封闭时间过短，非特异性过强；一抗非特异性过强；二抗非特异性过强；显
微镜荧光强度过强。
总之实验是喜欢强阳性，不喜欢假阴性，呵呵。任何实验都需要花时间摸索才
能找到其最佳的工作条件。
熟能生巧，边学习边练习边思考方能学好。有不足之处，敬请各位老师同学批评
指正，以使该实验更加臻美.

另附免疫组化常见问题解析。原理是相同的，只是最后的显色方法不一样，有
些问题有启发作用。