利用Trizol的方法提取细胞总RNA(参照Invitrogen公司Trizol说明书)
以下步骤要严格防止RNA酶降解RNA,所使用的离心管和枪头要用0.1%
DEPC水处理24h,然后高压灭菌并烤干。尽量快地进行操作,减少RNA降解。
细胞样本RNA提取
(1) 先加1ml
Trizol于1×10e7细胞中,若冻存细胞直接加入Trizol,不需解冻,吹打裂解后室温静置5-10min。(可-70℃,1月)
(2) 每1ml Trizol加入0.2ml氯仿),剧烈震荡(vigorously)
15s,室温静置2-3min。
(3) 在4℃下12000g离心15min。
(4)
小心吸出上清水相约500μl移入另一离心管(注意不要抽到蛋白层),加入500μl异丙醇(专用),颠倒混匀(不要太剧烈),-20℃放置30min~2h(RNA沉到底部)。
(5) 4℃
1,2000g离心10min,倒去上清液,底部可见针尖大小白色物质(RNA)。
(6) 加入1ml
75%乙醇旋转洗涤,洗涤异丙醇(RNA可以在70%乙醇中-80℃保存1年)。
(7) 4℃ 7500
g离心5min,去除乙醇(尽量用枪头吸干净)后晾5-10min(不要太干,否则难以溶解)。
组织样本RNA提取
(1) 取每50-100 mg组织将组织在液氮中研磨。
(2) 加1ml
Trizol,转移至EP管中,12000g离心10分钟,转移上清液至新的离心管中。
(3) 每1ml Trizol加入0.2ml氯仿,剧烈震荡(vigorously)
15s,室温静置2-3min。
(4) 在4℃下12000g离心15min。
(5)
小心吸出上清水相约500μl移入另一离心管(注意不要抽到蛋白层),加入500μl异丙醇(专用),颠倒混匀(不要太剧烈),-20℃放置30min~2h(RNA沉到底部)。
(6) 4℃
1,2000g离心10min,倒去上清液,底部可见针尖大小白色物质(RNA)。
(7) 加入1ml
75%乙醇旋转洗涤,洗涤异丙醇(RNA可以在70%乙醇中-80℃保存1年)。
(8) 4℃ 7500
g离心5min,去除乙醇(尽量用枪头吸干净)后晾5-10min(不要太干,否则难以溶解)。
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