固相合成技术

多肽的固相合成

       1963 年 Merrifield 提出 固 相 多 肽 合 成 方 法( SPPS，Solid PhasePeptide Synthesis) ，为多肽研究开辟了广阔的天地，并极大地推动了分子生物学等领域的发展，为此1984 年 Merrifield 被授予了诺贝尔化学奖。

固相合成的基本原理

      多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从 C 端( 羧基端) 向 N 端( 氨基端) 合成。首先将目的肽第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体相连，再以这一氨基酸的氨基为合成起点，经过脱去氨基保护基并同过量的活化的第二个氨基酸反应，接长肽链。

      重复( 缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合) 操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。

 合成方法

      目前固相合成多肽主要有两种方法: 一是叔丁氧 碳基合成法(Boc合成法) ; 二是: 9 － 甲氧羟基合成法( Fmoc 合成法) 。

 Boc 合成法

      采用三氟乙酸( TFA) 可脱除的Boc为α －氨基保护基，侧链保护采用苄醇类。

      合成时将一个 Boc保护的α － 氨基酸共价交联到树脂上，用 TFA 脱除Boc，三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过 DCC 活化、偶联下一个氨基酸，最终采用强酸HF 法或三氟甲磺酸( TFMSA) 将合成的目标多肽从树脂上解离。 

Fmoc合成法

Fmoc( 9 － 芴甲氧羰基) 基团作为α－ 氨基保护基的多肽合成方法—Fmoc 法。

      在Fmoc 法中，采用了可被碱脱除的Fmoc作为 α － 氨基酸的保护基，侧链采用酸脱除的 Boc 保护方法。Fmoc 作为氨基保护基的优点在于它对酸稳定，用 TFA 等试剂处理不受影响，仅需用温和的碱处理，侧链用对碱稳定的Boc 进行保护等。

肽段最后用TFA/二氧甲烷( DCM)定量地从树脂上切除，避免了采用强酸。Fmoc 法与Boc

法相比，由于 Fmoc 法反应条件温和，副反应少，产率高，而被广泛应用于多肽合成中。

步骤

聚合物载体

       目前用于固相合成的聚合物载体主要有三类: 聚苯乙烯 － 苯二乙烯联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯—乙二醇类树脂及衍生物。这些聚合物载体只有引入相应的连接分子，才能与氨基酸进行连接。

连接分子

      根据连接分子的不同，树脂又被分为几种类型: 氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂固相多肽合成使用过的连接分子为含有氯甲基、巯甲基、酰氯基、对苯甲酰基、芳磺酰氯基、烯丙醇基、丁二酰基、邻硝基苄醇基及二苯氯硅烷等的双官能团化合物

多肽的切割与沉淀

       按既定的顺序合成完多肽后，就要把目标多肽从树脂上切割下来，并进行进一步的纯化。由于多肽的合成有 Boc 法和 Fmoc 法两种，因此，它们的切割方法也不完全一样。在 Boc 法中，主要用 TFA+HF 裂解和脱侧链保护。在 Fmoc 法中直接用 TFA进行切割。以 Fmoc 法的切割为例，首先将反应的树脂用二氯甲烷洗涤几遍后，真空抽干。往装有树脂的多肽固相反应器中缓慢加入: 三氟乙酸/ 三异丙基硅烷/ 水( TFA/TIS/H2O) = 95 /2． 5 /2． 5 ( 体积比) 溶液，反应 3 h，过滤，氮气吹去大部分的溶剂后，向残液中倒入预先冷冻的无水乙醚，离心，倒去上层溶剂乙醚，向沉淀中再次加入无水乙醚，振荡，离心，再重复一次，除去大部分的杂质。将得到的沉淀真空干燥 24 h。固体残留物用离子水溶解，冷冻干燥得到白色絮状固体，－ 20 保存。