TRIzol法提取RNA
摘要  北京华夏远洋科技
TRIzol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，保护RNA的完整性 。在TRIzol法提取RNA过程中加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层，RNA存在于水样层中。将上层水样收集后，通过异丙醇沉淀即可得到RNA。
目录
一、实验原理
二、实验试剂
三、实验步骤
四、注意事项
五、常见问题
六、技术文档
七、技术视频
一、实验原理

TRIzol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，保护RNA的完整性 。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA 对于样品间标准化RNA 的产量十分有用。

无论是人、动物、植物还是细菌组织，TRIzol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。

二、实验试剂

1. TROzlo试剂、氯仿、75%乙醇(0.1% DEPC配制)。

2. 塑料器皿需用0.1% DEPC水浸泡。

3. 0.1%DEPC水：100ml dd水中加入DEPC0.1ml，充分振荡，37℃孵育12h以上，121℃高压灭菌20min，于4℃保存。

三、实验步骤

(一) RNA提取

1. 样品处理

(1) 组织：50-100mg组织中加入1ml TROzlo试剂。

(2) 单层细胞：加入TROzlo试剂1ml/cm2平板。

(3) 悬浮细胞：处理前洗涤细胞，以防止RNA降解。每5-10×105动物、植物或酵母细胞，或1×107细菌加入1 ml TROzlo试剂。

2. 将上述样品于15-30℃静置5min，使核蛋白充分解离。

3. 加入0.2ml(1 ml TROzlo试剂)氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15s并于15-30℃静置2-3min。

3. 于2-8℃ 12000g离心15min。离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA。

4. 取上清，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，于15-30℃静置10min后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA。

5. 于2-8℃ 12000g离心10min后弃去上清。

6. 向沉淀中加入1ml 75%乙醇，轻轻混匀。

7. 于2-8℃ 7500g离心5min后弃上清

8. 将RNA样品凉干(不要彻底干燥)，加入适量DEPC水溶解(可于55-60℃促溶10min)。

(二) RNA的定量

RNA(mg/mL)=40×OD260×稀释倍数(n)/1000

RNA纯品OD260/OD280=2.0

(三) 电泳检测

1. 用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。

2. 在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10×载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。

3. 打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。

四、注意事项

1. 所有离心管、枪头及相关溶液都必需无 RNA酶污染。耐高温器物可150℃烘烤4小时以除去RNA酶，其它器物除RNA酶可考虑用0.1%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌、烘干。溶液需用灭菌的DEPC水配制：加0.01%(体积比)DEPC至MiliQ级水中，处理过夜，灭菌即成DEPC水。

2. 必需戴一次性手套操作，且尽量不要对着RNA样品呼气或说话，以防RNA酶污染。

Trizol含有毒物质苯酚，避免接触皮肤或吸入。为防止溅入眼睛，请戴防护眼镜或使用透明保护屏。如皮肤接触Trizol，请立即用大量去垢剂和水冲洗，如仍有不适，请听取医生意见。

3. 从少量样品(1～10mg组织或102～104细胞)中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800mlTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5～10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。

4. 在匀化后和加入氯仿之前，样品可以在–60—–70°C保存至少一个月。RNA沉淀(步骤4，RNA洗脱)溶于75%的乙醇在2—8°C至少可以保存一周，在–5—–20°C下至少可保存一年。

五、常见问题

1. RNA低得率

(1) 样品裂解或匀浆处理不彻底。

(2) 最后得到的RNA沉淀未完全溶解。

2. OD260/OD280<1.65(一般所得RNA溶于DEPC水后的OD260/OD280值为1.6-1.8)

(1) 检测吸光度时，RNA样品没有溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，A280值会较高；

(2) 样品匀浆时加的试剂量太少；

(3) 匀浆后样品未在室温放置5分钟；

(4) 水相中混有有机相；

(5) 最后得到的RNA沉淀未完全溶解。

3. RNA降解

(1) 组织取出后没有马上处理或冷冻；

(2) 样品或提取的RNA沉淀保存于-5－-20&#8451;，未在-60－-70&#8451;保存；

(3) 细胞在胰酶处理时被破坏；

(4) 溶液或离心管未经RNase去除处理；

(5) 电泳时使用的甲酰氨pH低于3.5 。

4. DNA污染

(1) 样品匀浆时加的试剂体积太少；

(2) 样品中含有组织溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲液或碱性溶液。

5. 蛋白和多糖污染

离心去上清后得到的RNA沉淀经以下操作应可去除这些污染： 在上一步中，每使用1ml Trizol，在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液（0.8M柠檬酸钠和1.2 NaCl）。混合，离心，然后按照操作进行。这种方法可使蛋白多糖和多糖留在溶液中，而高效沉淀出纯RNA。从植物中提取RNA时，应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。