1. Gateway-T载体（pGWC）的酶切反应

pGWC除具有传统T载体的克隆功能外，还可以作为入门克隆（Entry Clone）与Gateway 重组克隆技术兼容。该载体中的ccdB基因编码一个能够使大多数E. coli致死的毒蛋白，可作为重组子的负选标记取代了蓝白斑筛选。

该载体在使用前，需经过AhdI（实验中采用其同裂酶Eam1105 I）酶切，使载体两端产生5’T，用与PCR产物的两端的3’A互补。PCR产物回收后与pGWC载体连接，挑取正向克隆送测序。

pGWC载体的酶切反应体系如下：

     将反应混和液于37℃温育6h。取1μl酶切反应液走1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，估测载体片段的浓度，该酶切反应液可直接用作连接无需纯化。

2. PCR产物的回收与连接反应

PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）进行回收，与pGWC载体进行连接。

DNA片段与pGWC-T的连接：

反应混合液于4℃下连接过夜（约12~16h）。

3. 连接产物的转化

取大肠杆菌DH5α感受态细胞（50μl/管）于冰上融化，加入5μl连接产物，用移液器轻轻吸打混匀，在冰上放置30min，42℃水浴热激90s，冰上放置5min，加入无抗生素的LB培养基300μl，37℃，160rpm振荡培养45min，将菌液铺在氯霉素抗性（25mg/L）LB平板上，在超净台吹干后37℃倒置培养过夜。

4. LR反应与表达载体构建

表达载体均采用Gateway重组克隆技术构建，目标基因连入pGWC后即为入门克隆（Entry Clone），通过与表达载体做LR反应构建目标基因的表达载体。

LR反应体系如下：

反应液于25℃反应4-6h，转化大肠杆菌DH5α，挑选单菌落进行鉴定，由于ccdB基因编码的毒蛋白可作为重组子的负选标记，因此阳性率非常高（可达90～99%）。