1. Gateway-T载体（pGWC）的酶切反应

pGWC除具有传统T载体的克隆功能外，还可以作为入门克隆（Entry Clone）与Gateway 重组克隆技术兼容。该载体中的ccdB基因编码一个能够使大多数E. coli致死的毒蛋白，可作为重组子的负选标记取代了蓝白斑筛选。

该载体在使用前，需经过AhdI（实验中采用其同裂酶Eam1105 I）酶切，使载体两端产生5’T，用与PCR产物的两端的3’A互补。PCR产物回收后与pGWC载体连接，挑取正向克隆送测序。

pGWC载体的酶切反应体系如下：

pGWC	10 μl（约2μg）
10×Eam1105 I Buffer	5 μl
Eam1105 I	2 μl
ddH2

现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因，如AH109酵母株含有三类报告基因—ADE2、HIS3、MEL1/lacZ，这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性的GAL4-反应元件和三类启动子元件-GAL1、GAL2以及MEL1（如图6-1-1）。通过这种方法就消除了两类最主要的假阳性，一类是融合蛋白可以直接与GAL4结合位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性；另一类是融合蛋白和某种转录因子结合后再结合到特定的TATA盒上所带来的假阳性。ADE2一种报告基因就已经能够提供较强的营养选择压力，这时选择性地使用HIS3报告基因，一来可以降低假阳性率；二来可以控制筛选的严格性（如果需要筛选与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白，就可以同时使用ADE2、HIS3两种报告基因；如果只需要筛选与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白，就可以使用ADE2或HIS3两者中的一种）。MEL1和lacZ分别编码a-半乳糖苷酶和b-半乳糖苷酶，可以作用于相应的底物X-a-Gal和X-b-Gal使酵母变蓝。其中，a-半乳糖苷酶是外分泌酶，在酵母表面就能直接检测到；b-半乳糖苷酶是内分泌酶，需要将酵母破碎后才能检测到。用蓝斑显示酵母细胞内两个蛋白的相互作用的方法不仅具有较高的敏感性，而且蓝斑的深浅还可以反映两个蛋白相互作