产品简介

常规化学合成siRNA为21-25nt的双链小分子RNA，即用型。

运输与保存

产品一般以冻干粉的形式常温运输。收到产品后，请于 -20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年以上。使用前请用灭菌的RNase-free H₂O或者灭菌的ddH₂O，配制成20μM溶液，建议分装保存，避免反复冻融 (尽量不要超过5次)。如需要长期保存，产品请以冻干粉形式保存。

表1  20μM存储液的配置

注：如需进行筛选试验，可选择以96孔板密封的冻干粉或液体形式提供的siR-Ribo^TM siRNA Library

使用方法

产品已经经过纯化、退火等处理，只要用灭菌的ddH₂O或RNase-free water溶解即可直接转染细胞或供动物实验使用。为避免外界因素(包括酶，极端pH或者温度条件等)导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。

细胞实验

为了降低因细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议：

a. 每次转染实验时，每个转染样品至少设置3个复孔；

b. 接种细胞时，尽量接种相同或相近数量的细胞于细胞培养板，使细胞在各孔的表面均匀分布。

1. 转染浓度：

最佳转染效率一般设置时间曲线和浓度梯度进行测试，推荐初始的转染时间为6h，转染后检测的时间为24-72h，初始转染浓度是50nM，可视具体情况优化，建议优化转染浓度梯度为100nM，50nM，30nM，20nM，10nM (表2)。

2. 转染步骤：以lipofectamine^TM 2000(简称lipo2000) 转染siRNA于24孔细胞培养板为例，其他规格容器转染请参考表2。

1)  转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50%汇合度 (不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)。注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过密可能会削弱细胞活力，导致细胞转染效率的降低。

2)  对于每个转染样品，按如下步骤准备siRNA-lipo2000混合液：

a.  稀释siRNA：用50μl不含血清培养基Opti-MEM^®Ⅰ(v2)稀释25pmol siRNA (加入细胞中的RNA终浓度50nM)，轻轻混匀，室温孵育5min；

b.  稀释lipo2000：用50μl不含血清培养基Opti-MEM^®Ⅰ(v2)稀释1μl lipo2000，轻轻混匀并室温孵育5 min；

c.  将a与b轻轻混匀，室温孵育20min（溶液可能会有浑浊，但不会影响转染）。

注：稀释好的lipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在25min之内与稀释好的siRNA混合。混合试剂请勿剧烈吹打或振荡，手指轻弹管壁即可，过度用力可能会破坏试剂中脂质体结构及siRNA-lipo2000混合物的形成。

3)  将siRNA-lipo2000混合液加入含有细胞以及培养液(v1)的培养板各孔中，轻轻混匀；

4)  将培养板置于37 ℃的CO₂培养箱中培养24-96h (检测时间与研究实验目的有关。培养4~6h后，可以将孔里含有siRNA-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜的生长培养基，也可以进行其他必要的特殊处理(如加药处理)。

表2  使用lipo2000(invitrogen)转染siRNA产品用量参考

V1：完全或不完全培养基；v2: Opti-MEM^® I (无血清、无抗生素，转染专用)

*：实验参考用量示例；当实验涉及DNA共转时参考

动物实验

动物模型：根据实验需要选择合适的动物模型，以小鼠最为常用，用量较小(表3)。

修饰方式：由于动物实验对siRNA稳定性的要求较高，尽管未修饰的siRNA也可以进行动物实验，但是以Chol，OMe，PS修饰的siRNA最为常用，效果较好。

给药方式：静脉给药：适合心、肝、肾、肺、原位瘤等血流丰富的组织器官；呼吸道给药：适合呼吸系统；腹腔给药：适合腹腔和盆腔内脏器，胰、脾、肾、卵巢等；颅内给药：脑部，适合中枢神研究；局部给药：眼、皮肤、子宫腔、阴道、移植瘤等。

效果检测 ：锐博生物提供标记有Cy3、Cy5的siRNA可以进行实时观测药物分布，其他效果检测应根据实验目的进行设置。

表3 动物siRNA实验使用方法参考 *: 更多信息请点击www.siRNA.cn/siRNA/invivo.aspx