1.宏基因组测序总DNA的提取有哪些注意事项？

获得高质量的环境样品总DNA是宏基因组测序能否成功的关键。为了提取的DNA能够代表特定环境样品中的微生物种类，取样时必须严格遵循采样标准，尽量避免对样品的干扰，缩短保存和运输的时间，以尽可能地保持样品的微生物原貌。若要对功能基因簇进行研究，在提取DNA时，既要尽量完全地抽提出样品中的DNA，又要使获得的DNA保持较大的片段，因此在DNA提取时要在最大提取量和最小剪切力之间进行折中。

2.采用Illumina高通量测序平台进行宏基因组测序，应如何构建文库？

从环境样品中提取总DNA后，进行测序文库制备，具体步骤如下：① 用物理方法将DNA随机打断成200～500bp的片段；② 对DNA末端进行平滑化及修复处理；③ 3’末端加“A”碱基；④ DNA两端加上“Y”型接头；⑤ PCR扩增使两端连上不同的接头序列；⑥ 检测文库质量。

3.在宏基因组学研究中，功能基因簇研究的技术路线是什么？

功能基因簇的研究方法是通过构建宏基因组文库（BAC、Fosmid、Cosmid），用表型功能的方法筛选阳性克隆并进行测序。具体技术路线如下：

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4.如何进行pathway分析?

常用的pathway数据库包括KEGG、Reactome、BioCyc、RegulonDB、 WikiPathwans等。其中，KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）共包含19个子数据库，能对基因功能、基因组信息进行系统分析，并将基因和表达作为一个整体网络进行研究。其子数据库GENES中包含完整或部分的测序基因组序列；Pathway数据库中包含基因功能信息，如膜转运、信号传递、代谢、细胞周期等。KEGG的另一个数据库LIGAND中则储存了大量的化学信息，包括化学物质、酶、催化反应等。另外，KEGG还提供了出色的整合代谢途径查询，结果中不仅包含了所有的可能代谢途径，而且还对参与各步反应的酶进行了全面的注释，如氨基酸序列、PDB链接等。