1.PCR产物直接测序和PCR产物经克隆后测序的结果有何区别？

在PCR圹增过程中会出现很多错配现象，而错配的位置是随机的，所以用PCR产物直接测序时，测定的是多个分子的混合物。但是在某一个位置出现错配的分子所占的比例非常小，大部分的分子在这个位置的碱基还是正确的，因此测序结果仍能正确体现测序模板的序列信息。

PCR产物经克隆后测序则是测定某一个分子的DNA序列，因此测序结果中往往存在着一些错配的序列，与原模板相比，个别碱基会有所不同。而这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。为了减少错配现象，请选用高保真的DNA聚合酶。

2.过短的PCR产物为什么不适合直接测序？

首先，过短的PCR产物纯化非常困难。一般的PCR产物纯化试剂盒都要求产物片段大于150bp，过短的PCR产物纯化和准确定量都非常困难，因此我们要求用于测序的PCR产物长度一般不低于150bp。其次，由于测序技术本身的限制，测序反应对环境的干扰比较敏感，当模板太短时，干扰更大，很容易造成测序失败。

3.我有一个4Kb的PCR片段，该如何测通呢？

当PCR片段大于2Kb并需要测通时，最好构建克隆再进行测序，这样模板会更加稳定，获得测序结果也会更好。

详见美吉生物网站：http://www.majorbio.com/