1.有哪些引物不适合测序？

不适合测序的引物主要包括以下几种：

1)简并引物

简并引物在测序模板上有多个结合位点，会直接影响测序结果。

2)随机引物，如RAPD引物

随机引物一般较短，所用退火温度较低，在测序时不能很好地与模板结合。

3)过长的引物

一般要求测序引物不大于24bp，最长不能超过30bp。过长的引物不仅会导致测序结果背景增高，而且引物合成的纯度也难以保证。通常用于测序的引物纯度要在90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将明显增大，直接影响测序结果。

4)有特殊标记的引物

有特殊标记的引物主要是指荧光标记的引物。因为测序反应中的四种碱基都是带有荧光标记的，若引物也带有荧光标记将对碱基识别造成干扰。另外，一些带有大的标记基团的引物也不适合用于测序，因为这些大的标记基因将直接影响DNA片段的迁移率，从而导致测序结果峰型不好或错误。

5)不纯的引物

测序引物对纯度的要求很高，合成的引物中非全长的片段会造成较强的背景。以一个20bp的测序引物为例，若只采用脱盐纯化，其纯度至多达到70%左右，而其他30%的引物将成为背景噪音，这必将严重影响测序结果。一般经PAGE或OPC法纯化的引物基本能达到测序的要求。

2.如何选择或设计测序引物？

与PCR用引物相比，测序用引物要求要严格得多，在选择或设计测序引物时，必须严格满足以下几个要求：

1)长度在15～25bp左右，一般选择20bp，可根据GC含量作适当调整。

2)3’端尽量选择G或C碱基（不绝对），以增加引物与模板的结合能力。

3)Tm温度应在50℃～70℃。

4)GC含量应在50%左右，并尽量避开A、T、G、C的连续结构。

5)避免引物自身形成发夹结构或引物间形成结构二聚体。

6)保证引物和模板完全匹配，特别是3’端的几个碱基一定要100%匹配。同时必须严格保证引物和模板之间只有一个结合位点。