浅谈《基因工程的基本操作程序》中的几个问题

储昭灿

（安徽省岳西中学，czc20022002@163.com）

摘  要：高中生物《选择性必修3》[人教2019版(以下称“新教材”)]第3章，第2节安排的是《基因工程的基本操作程序》。这一节中，有许多问题需要广大师生突破教材，进一步组织教材中相关内容，才能更好地构建出相应知识体系。本文主要以问题为导向，从“如何获取目的基因”、“如何理解PCR技术中几个关键问题”、“什么情况下需要构建基因表达载体”等方面进行阐述，以期为广大同仁进行本节教学积累点滴资料，也希望对高中学子有点滴启发，更好地理解本节知识，提升自身的学科素养。

关键词：高中生物教学  学科素养  目的基因  基因表达载体

引  言

组织学生系统地学习《基因工程》，能激发学生对现代生物技术产生浓厚兴趣，拓展学生的视野，有效提升学生的生物学学科素养和科学思维能力，并对生物学前沿研究有更深层次的认识。

由于《基因工程的基本操作程序》这一节涉及的部分问题难度大、专业性强，有些问题在教材中只进行了简单描述，适合高中学段的学习资料也相对较少，导致老师在这一模块的教学过程中面临许多困难，学生的知识体系不完备，也只能死记硬背式地学习。笔者认为，在教材安排内容的基础上，老师应再给出一些让高中学生能够看得懂的资料，系统地对基因工程的基本操作程序中涉及的一些问题进行再设问、再补充和再拓展，促使学生为之进行思考式学习。

一、适度拓展获取目的基因的方法

新教材中对目的基因的阐述以及如何筛选合适的目的基因，通俗易懂。但在回答如何获取目的基因这个问题时，虽然涉及到对测序技术、序列数据库、序列对比工具等新技术的应用，但未进行详细介绍。

1．除了利用PCR技术获取目的基因，还有许多其他方法

目前为止，获取目的基因的方法只有两大类：人工合成目的基因或通过各种方法从生物体中提取目的基因片段。新教材中也指出了获取目的基因的方法有多种，“利用PCR技术获取和扩增目的基因”是当前的常用方法。

许多获取目的基因的方法现在已不再常用，但每一种方法都充满创造性思维，都是提升学生思维能力的良好材料，建议老师在上课时，多介绍几种获取目的基因的方法。

1.1人工合成目的基因

问题1：为什么要人工合成目的基因？

人工合成目的基因是在没有模板的情况下，通过化学途径合成出所需DNA片段。

比如，为了合成一种生物体中没有的全新蛋白质，需要人工设计其氨基酸序列，再设计出相应DNA序列，这种情况下，没有DNA或可以与之互补配对的RNA模板可用，就要完全依靠化学途径来合成该DNA。

通过了解化学合成DNA的方法，能够激发学生的学习兴趣。老师可以通过引导学生思考一些问题，组织学生进行一些讨论活动，将DNA分子结构、DNA复制和DNA分子重组等知识形成有机联系，帮助学生构建知识体系。

问题2：一次性合成一个较大DNA分子很难，应怎么设计合成过程？

1.1.1小片段粘接法

按照目的基因的序列，先合成一些小的(12~15个碱基)、可以互补的单链片段，互补配对成双链后，用DNA连接酶将这些双链片段按顺序连接起来(图1)。

 

问题3：联系细胞中DNA分子合成过程中，后续链上形成许多冈崎片段，这些片段之间的RNA单链引物会被降解，那暴露出来的单链DNA怎么形成双链结构？这对人工合成DNA有什么启发？

1.1.2补丁延长法

按照目的基因的序列，先合成大小不一的较短单链DNA片段，它们之间有互补区段，互补后，每条单链都不完整，但其3＇端均可为Klenow DNA聚合酶提供延伸位点，从而将其延伸成完整的DNA双链结构(图2)。

 

1.1.3大片段酶促法

基本原理和小片段粘连法及补丁延长法类似，需要先合成40~50个碱基的DNA较大单链片段，然后按目的基因序列将这些单链互补并连接，不能互补的单链区域通过DNA聚合酶和DNA连接酶补齐，形成完整DNA分子。

1.2获取“已知结构和功能清晰的目的基因”

不要人工合成，只需要在生物体中提取即可。如果所需目的基因在基因组较小的生物体中，获取相对较容易，否则较难。现以从细胞中获取目的基因为例来进行说明。

1.2.1从细胞中直接获取

这是最初的一种获取目的基因的方法。常用“鸟枪法”——提取细胞中DNA，将细胞中的DNA用限制酶酶切成许多小DNA片段，再将这些片段与运载体相连接，分别导入不同受体细胞中，这些DNA片段随受体细胞分裂而复制，进而筛选到所需目的基因片段。

常用筛选方法有：“菌落原位杂交法”——利用可以和目的基因单链片段互补配对的、带标记的单链DNA或RNA探针来检测某一菌落中是否含有所需DNA；“外源基因产物功能检测法”，如，筛选某种抗生素抗性基因，在培养基中加入该抗生素，然后到能够存活的受体菌群中去进一步选择所需DNA片段。

这种方法现在使用较少，但思路独特，能在一定程度上提升学生的科学思维能力。

1.2.2通过分离出目的基因的mRNA，逆转录出目的基因片段

细胞质中mRNA种类繁多，如何找到人们所需要的某个特定mRNA分子就要有恰当的方法。

科学家想到一个简单又富有创意的办法——钓取目的基因的mRNA。

利用多聚胸腺嘧啶重复核苷酸链[只有胸腺嘧啶脱氧核苷酸组成的长链，Oligo(dT)]结合到纤维素柱上，形成Oligo(dT)-纤维素柱，大多数mRNA的3＇末端含有多聚腺嘌呤重复序列，将从细胞中提取到的RNA流经Oligo(dT)-纤维素柱，通过Oligo(dT)的胸腺嘧啶脱氧核苷酸重复序列和mRNA分子3＇末端之间互补配对，将mRNA结合到纤维素柱上，其他RNA流走。再利用目的基因的特定序列制作的探针来定位其转录出来的mRNA，以之为模板逆转录出目的基因。

1.2.3从基因文库获取目的基因

将含有某种生物不同基因的DNA片段分别导入不同受体菌群中，并可随受体菌繁殖而复制，这些受体菌群就称之为该种生物的基因文库。分为基因组文库(包含某种生物的所有基因)和部分基因文库(只含某种生物的部分基因)，cDNA文库(从生物体细胞中提取总mRNA，以它们为模板逆转录出相应DNA，构建该种生物的基因文库)就是常见的部分基因文库。结合这个问题，能通过问题引导学生理解基因的选择性表达以及核基因转录成的RNA需经过进一步剪接才能形成成熟的mRNA。

问题4：构建出某一生物的cDNA文库为什么只是部分基因文库？用mRNA逆转录出的cDNA和转录出该mRNA的核基因之间有什么差异？

从构建好的基因文库中，可根据实际应用，方便快捷地找到所需目的基因。

1.2.4利用PCR获取目的基因

用这一技术获取目的基因是指在不用限制酶酶切的情况下，根据目的基因片段两端的一小段序列(以每条链的3＇末端序列设计引物对)，就可以通过PCR仪来复制出所需目的基因片段。然后再利用这一技术对目的基因片段进行大量扩增，增加其数量。当然，用此方法获取目的基因和扩增目的基因是两个概念，在教学过程中要做好区别。

2．对PCR技术中两个关键问题的理解

教材中对PCR的一些介绍并不具体，需要老师在讲解的过程中加以明晰。如：教材中有“分别与两条模板链结合的2种引物”这句话，那学生需要了解下列相关问题，才能较深层次地理解PCR。

2.1关于PCR所用引物问题

2.1.1设计引物的理由

DNA聚合酶不能起始合成DNA链——只能将游离的脱氧核苷酸连接到已有的引物(一段RNA或DNA单链)的3＇端。这样，学生就知道为什么进行PCR时要设计引物对了，同时，还可以拓展两个问题：

问题5：细胞内DNA复制所用引物为什么是RNA单链？

问题6：能否给必修1中的“端粒学说”——细胞分裂会导致染色体端粒长度变短，给出合理解释？

通过这些问题的探讨，可以和必修1中的“端粒学说”、必修2中的“DNA分子复制”相联系，完善学生的知识体系。

2.1.2怎么设计引物对

问题7：为什么要对待扩增DNA两端进行测序？

待扩增的DNA中每条链的3＇端是引物的结合位点，根据每条模板链的3＇端序列设计好特异性引物，就可以在反应体系中让子链从5＇→3＇端延伸，从而复制出一个完整的DNA分子。即，DNA聚合酶要引物为之提供3＇端位点。

2.1.3引物对的设计要求

每一引物长度一般需要20~30bp，太短则特异性差，太长没有必要；两种引物之间不能相互配对成双链；引物自身不能折叠形成双链。

2.2关于PCR过程中“复性”理解

DNA热变性后，经过缓慢降温可以再配对成双链结构而“复性”，所以，要跟学生讲清楚PCR过程中所讲的“复性”是指让引物对结合到各自模板链的3＇端，不能理解为让DNA双链恢复。

二、如何理解“重组质粒”和“基因表达载体”

1．在什么情况下要构建“基因表达载体”

这一问题，教材及一些资料中的描述都不是很清楚。

如新教材P₈₁的农杆菌转化法示意图中，将目的基因和Ti质粒相连接写成“构建表达载体”，实际上这一操作并非是构建基因表达载体。

要理解好这一问题，需要对目的基因进入受体细胞后，以什么方式稳定存在、复制及表达有较好的认识。新教材P₇₂中“携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。”的这句话，应该解读为下面两种情况：

1.1能将目的基因整合到受体细胞的DNA上——无需构建基因表达载体

如：农杆菌转化法是将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，利用T-DNA能整合到受体细胞的染色体DNA中，从而将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上。这就无需目的基因以“表达载体”的形式在受体细胞中存在。

1.2不能将目的基因整合到受体细胞的DNA上——需要构建基因表达载体

如果不能将目的基因整合到受体细的DNA上，就只能以基因表达载体的形式存在于受体细胞中，以保证其能稳定存在并且随受体细胞的分裂而复制、在受体(的某些)细胞中表达目的基因。

2．怎么构建基因表达载体——重点理解“启动子”

常用质粒来构建基因表达载体，在基因工程所涉及的操作中，属于核心技术。

用来构建基因表达载体的质粒除了要有复制原点，还要有四大基本元件：一至多个抗性基因(充当标记基因)、适宜的启动子、目的基因、终止子。其中，重点是如何理解目的基因首端的启动子。

问题8：启动子是什么？启动子有什么作用？

教材中指出：“会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。”学生要理解这个问题，则不可避免地要面对以下问题：

2.1启动子

启动子是一段特殊的DNA序列，在基因上游，RNA聚合酶识别并与之结合后，以基因中3＇端在启动子端的单链为模板，转录出相应的mRNA。

知道了这个问题，学生自然就能理解另一个关于构建表达载体的问题：

问题9：为什么目的基因不能反接？

2.2启动子的类型

问题10：除诱导型启动子，启动子还有哪些类型？

 

还有组成型启动子和组织特异型启动子。

其中，建议重点给学生介绍一点关于组织特异型启动子，因为在后边会讲到“生物反应器”，学生就能结合基因的选择性表达知识，更好地理解“乳腺生物反应器”或“膀胱生物反应器”。

组成型启动子也是常用的启动子，与诱导型启动子不同，能使目的基因在所有组织细胞中启动表达；也不同于组织特异型启动子，组成型启动子使目的基因的表达具有持续性，但没有时空特异性。

讨论

通过对教材的再处理，收集、开发高中学段学生能看懂的材料，组织学生系统地学习一些关于基因工程方面的知识，意义重大。

首先，基因工程技术是当前无可争议的研究热点之一，其中有许多问题尚待解决。结合这一领域的发展史以及相关技术思路、方法等，可以培养学生的学习兴趣，有必要引导更多学生在不久的将来从事这方面的研究，成为该领域的高端人才。

其次，人类对基因工程技术的依赖越来越多。这就要求更多的人对基因工程技术有一定的认知，意识到基因工程技术可以给人们解决诸多问题。比如：制药、诊断疾病、治疗疾病、解决能源问题、提供各种生产原料、改良农作物等等。通过更多地了解《基因工程的基本操作程序》，在一定程度上开阔学生眼界，拓宽学生学习生物学的思路，并认同基因工程技术对人类有积极作用。

再次，怎么让更多的人正确认识基因工程的安全性，怎么面对基因工程带来的各种伦理问题，基因污染问题等，也要求对更多的人进行相关知识普及。另外，要树立学生正确的人生观和价值观以及建立生物学科的社会责任，将来用所学知识造福人类，而不是利用新技术从事危害人类及自然的活动。

 

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