梯度洗脱原理及其应用

    对于组分复杂的样品，采用一种色谱体系，很难得到理想的分离结果。要么分离时间太长，要么分离度太差。

    液相色谱中采用梯度洗脱,目的：缩短的时间；提高分离效果。

    梯度洗脱特点：

    梯度洗脱中为保证流速的稳定，必须使用恒流泵，否则难获重复结果。

    流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k'，并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。

    梯度洗脱常用一个弱极性的溶剂A和一个强极性的溶剂B。A溶剂为低强度；B溶剂为高强度，B溶剂的强度应能够在梯度过程中使所有欲测谱带都能被洗脱，并使各谱带的k’值在2-10之间。   

    提高柱效,改善检测器的灵敏度,当样品中的一个峰的k'值和最后一个峰的k'值相差几十倍至几百倍时，使用梯度洗脱效果特别好。

    梯度范围：

    指流动相中,强溶剂分别在起始液和终止液中的浓度。调节梯度范围,对得到最佳的梯度分离起重要作用。

    最佳梯度范围：

    第一个峰出峰时间大约为2倍的t0，t0是一个柱体积的液体流过时间。梯度结束时把最后一个峰洗脱出来。

    梯度洗脱的形式

    线形梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化与梯度时间成线性比例。在一定时间内，流动相强度越大，直线斜率越大。

   指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随梯度时间变化称指数关系。

   凹形：梯度起始阶段强度变化缓慢，随时间增加，强度变化加快。

   凸形：起始阶段梯度速度变化快，终止阶段梯度速度变化慢。

   折线形：在阶梯浓度之间，有线性浓度增加。

    台阶形：只有阶梯浓度。

    梯度洗脱一般应给出下列条件：

    起始液（A液）、终止液（B液）、起始时间（min）、终止时间（min）、梯度速度（B% /min）。

记录梯度溶液性质变化的曲线，称“梯度曲线”。在这个洗脱条件下，记录被洗脱物质分离状态的曲线，称“洗脱曲线”。

    几种梯度曲线：

二侧是洗脱曲线，中间的小图是建议采用的梯度曲线：

    白线，是洗脱曲线。