5.2溶液配制

5.2.1 Tricine凝胶buffer

称取SDS 0.3g，Tris 36.5g，用5M HCL调pH至8.45，定容至100mL。4℃保存，长菌时不能使用。

5.2.2 5M HCL

浓盐酸稀释2.4倍，现用现配。

5.2.3 49.5% Arc/Bis，3%C凝胶贮液

称取48g丙烯酰胺，1.5g甲叉双丙烯酰胺， 蒸馏水溶解并定容至100mL。4℃保存，长菌时不能使用。

5.2.4 50%甘油

取50mL甘油，加蒸馏水至100mL。室温保存，三个月内使用。

5.2.5 10％过硫酸铵溶液

称取过硫酸铵10g，蒸馏水溶解并定容至100mL，分装成1.5mL/支。冷冻保存，一年内使用。

5.2.6 正极缓冲液

称取 Tris 24g，用800mL蒸馏水溶解，1M HCL调pH至8.9，定容至1L。室温保存，一个月内使用。

5.2.7 负极缓冲液

称取Tris 12.1g，Tricine 17.9g，SDS 1g，加水溶解，定容至1L。4℃保存，一个月内使用。

5.2.8 还原型样品缓冲液（2×）

量取100mM Tris-cl 1mL、溴酚兰20mg、十二烷基硫酸钠0.4g、甘油2mL、DTT 0.3g，加蒸馏水溶解并稀释至10mL，冷冻保存，一年内使用。

5.2.9 考马斯亮兰染色液

称取考马斯亮兰R-250 0.25g，加入甲醇45mL、冰醋酸10mL、蒸馏水45mL，混匀即成，可重复使用3-5次，室温保存。

5.2.10 脱色液

取甲醇450mL、冰醋酸100mL、蒸馏水450mL，混匀，室温保存，3个月内使用。

5.3实验流程

5.3.1 凝胶模具的组装与检漏

     取1.0mm厚度的长短玻璃板，清洗干净后组装模具。注：短板朝里，若只跑一块胶，电泳夹的对面也必须放置一块电泳板。模具组装完成后，沿长短玻璃板之间形成的空隙加入注射用水直至水加满，平放模具。30S后，若液面不下降，则倒掉模具中的水，侧立模具并用滤纸吸干长短玻璃板间的注射用水。若模具漏水，则重新组装模具。

5.3.2 Tricine SDS-PAGE 凝胶配制

（1）下层胶：16.5%分离胶  10mL

注射用水                   0.68mL

Tricine 凝胶Buffer           3.4mL

49.5%Arc/Bis 3%C凝胶储液   3.4mL  

50%甘油                    2.72mL   

TEMED                     5μl

                 10%AP                     100μl            

（2）上层胶：5%浓缩胶Buffer   6mL

水                         3.6mL

Tricine 凝胶Buffer           1.24mL

49.5%Arc/Bis 3%C凝胶储液   0.4mL  

TEMED                     6μl

         10%AP                     60μl             

先配制下层胶，按下层胶配方依次加入相应溶液后，立即混匀（尤其是加入TEMED和10%AP时动作要快），倒入准备好的凝胶模具中，注意勿打入气泡，高度至槽高2/3-3/4。用移液器在凝胶上方轻轻加入蒸馏水，水封。20min凝胶聚合后，倒掉模具中水封用的蒸馏水，侧立模具，用滤纸吸干模具中的水，但不要接触到下层胶。再配制上层胶，向模具内倒入上层胶至满，插上1.0mm厚度的梳齿。20min凝胶聚合后，拆下模具托盘，将装置放于电泳槽中，向玻璃板之间加入负极液至漫过短板，在外侧尽量多地加入正极液。注：负极液必须漫过短板，正极液加入时不要和负极液相通，双手均匀用力拔出梳齿。

5.3.3 电泳

将供试品用注射用水稀释至0.2mg/mL，取30uL与2×还原型上样缓冲液30uL以1：1混合（两复孔），煮沸5min，上样量20μl/孔。分子量标准65℃预热5min，上样量10μl。恒流35mA电泳，约2-3h结束。理化对照品取一支，使用1mL注射用水溶解，然后用注射用水稀释至1mg/mL，取20uL与2×非还原型上样缓冲液20uL以1：1混合，煮沸2min，点样量20μl/孔。

5.3.4 染色和脱色

将电泳后的凝胶浸入装有染色液的容器中，于摇床上低速震荡染色约30min，然后更换为脱色液，于摇床上低速震荡脱色至背景全无。

1. 数据处理

观察样品的迁移率是否与对照品一致。