1.5 重组质粒pET28a(价格750元)-BmTnCⅢ的构建与鉴定将表达载体 pET-28a与扩增得到的 BmTnCⅢ基因片段均用限制性内切酶 BamHⅠ和 HindⅢ酶切后连 接 ， 转化大肠杆菌TG1得到重组质粒pET-28a-BmTnCⅢ。提取重组质粒，进行 PCR 鉴定，结果有与预期大小一致的条带，阴性对照无条带；重组质粒用 BamHⅠ和 HindⅢ进行双酶切并电泳，结果在 462 和 5 000 bp 附近出现两个条带，证实重组成功(图 5)。 将重组质粒进行 DNA测序分析，结果发现克隆得到的 BmTnCⅢ基因序列完全正确(图略)。

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1.6 pET-28a-BmTnCⅢ的诱导表达及纯化
经终浓度为 1 mmol/L 的IPTG诱导的pet28a重组菌，超声裂解后的电泳结果显示，表达的融合蛋白既存在于上清中，也存在于沉淀中，而上清中的含量较高，即该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达(图6)。将诱导的重组菌利用超声波进行破碎，再将获得的上清用于亲和纯化。纯化后所得到的目的蛋白经载体构建获得 10 kD 超滤离心管脱盐浓缩后，浓度高达5mg/mL。由图 7 中可以看到，重组菌裂解液中的目的蛋白 rBmTnCⅢ几乎完全与亲和层析介质结合，经过50 mol/L 咪唑溶液洗涤非特异结合蛋白后，目的蛋白用 100 mol/L咪唑溶液洗脱下来。 虽然纯化超滤浓缩后的目的蛋白仍然还有小分子量的杂蛋白存在，但是杂蛋白的含量不高，目的蛋白的浓度达到 95%以上，不会影响多克隆抗体的制备.

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1.7 检测
用 Western blot 检测了未诱导 诱导的重组菌总蛋白以及纯化的融合蛋白与自制抗体反应的特异性(图 8) 由图 8 可以看出，pet28a载体制备的抗体虽然是多克隆抗体，但仍然有较高的特异性.

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