1.5 重组质粒pET28a(价格750元)-BmTnCⅢ的构建与鉴定将表达载体 pET-28a与扩增得到的 BmTnCⅢ基因片段均用限制性内切酶 BamHⅠ和 HindⅢ酶切后连 接 ， 转化大肠杆菌TG1得到重组质粒pET-28a-BmTnCⅢ。提取重组质粒，进行 PCR 鉴定，结果有与预期大小一致的条带，阴性对照无条带；重组质粒用 BamHⅠ和 HindⅢ进行双酶切并电泳，结果在 462 和 5 000 bp 附近出现两个条带，证实重组成功(图 5)。 将重组质粒进行 DNA测序分析，结果发现克隆得到的 BmTnCⅢ基因序列完全正确(图略)。

http://s2/mw690/6de86a16gd32ac3036c51&690

1.6 pET-28a-BmTnCⅢ的诱导表达及纯化
经终浓度为 1 mmol/L 的IPTG诱导的pet28a重组菌，超声裂解后的电泳结果显示，表达的融合蛋白既存在于上清中，也存在于沉淀中，而上清中的含量较高，即该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达(图6)。将诱导的重组菌利用超声波进

Plasmid Name: pET-28 a (+)
Alt Names: pET28a
Source/Vendor: EMD Biosciences
Plasmid Type: Bacterial
Viral/Non-viral: Nonviral
Stable/Transient: Transient
Constitutive/Inducible: Constitutive
Expression Level: High
Plasmid Size: 5369
Sequencing Primer: T7 Fwd
Sequencing Primer: Sequence 5'd[TAATACGACTCACTATAGGG]3'
Protein Tags: His (Nterm and Cterm)
Bacterial Resistance: Kanamycin
Notes: Nterm thrombin cleavage site; a,b,c vary by MCS;
Catalog Number: 69864-3

Vector Map:

http://s14/middle/6de86a16g94b1a5ca365d&690

pet28a载体价格750元，pet28a载体图谱请见上方。实验室现有JM109，DH5a,B21(DE3),TOP10等4种感受态细胞。按理说最好是用B21（DE3），但是其转化效果最差。推测酶切和连接都

pET28载体具有T7噬菌体的启动子和终止子，因此不需要额外添加启动子，除非你做多启动子。你的ATG前可具有若干碱基，也可以没有，并且可以不符合读码框。因为启动子后区域到终止子都是被转录的，而阅读框只是在对翻译过程有影响。但ATG前插入序列不宜过长，以免影响启动子效率。a\b\c型号载体读码框位置不同，购买的时候请注意。

用pet-28a载体的原核表达出来的蛋白在破菌前肯定会出现在菌体沉淀中，不会分泌在培养基上清中的。至于破菌以后，表达出来的在沉淀中还是在上清中，要由目标蛋白的性质来定了，没有固定形式的。
至于是否是包涵体，主要也是由目的蛋白的性质与表达量来决定的，pet-28a这种载体没有本身溶解性高的多肽融合蛋白，也没有催化二硫键形成的酶融合蛋白，而且不含信号肽序列，所以同一种蛋白用这个载体，形成包涵体的可能性更大些。

相对其他生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源生物基因，特别是外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数的外源基因即便能分泌表达，其表达率通常也比包涵体方式低得多。
蛋白产物N端信号肽序列是蛋白质分泌的前提条件，如果楼主用pet-28a载体表达的外源基因