加载中…如何防止pET28a中NcoI的ATG影响目的基因的表达？
(2010-11-13 21:34:03)
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pet28a引物设计ncoi杂谈 |
分类： pet28a |
14941065：
我想在目的基因上游加NcoI酶切位点（C/CATGG），把目的基因连到pET28a上。
因为目的基因自身也有ATG，而用NcoI酶切后与pET28a连接上后NcoI也会剩一个ATG，所以目的基因前面也有个ATG了， 翻译应该是从NcoI酶切剩下的ATG开始的吧，
如果在目的基因上ATG翻译之前，先终止一次的话，后面的目的基因还可以继续翻译吗？
或者还有其他方法 让pET28a中Nco1酶切后剩的ATG不影响目的基因的表达？
请相关人才赶快指点一下哈！
谢谢！
因为目的基因自身也有ATG，而用NcoI酶切后与pET28a连接上后NcoI也会剩一个ATG，所以目的基因前面也有个ATG了， 翻译应该是从NcoI酶切剩下的ATG开始的吧，
如果在目的基因上ATG翻译之前，先终止一次的话，后面的目的基因还可以继续翻译吗？
或者还有其他方法 让pET28a中Nco1酶切后剩的ATG不影响目的基因的表达？
请相关人才赶快指点一下哈！
谢谢！
或者目的蛋白前面有几个杂氨基酸会影响目的基因的活性吗？
MisakaMisaka：
我想在目的基因上游加NcoI酶切位点（C/CATGG），把目的基因连到pET28a上。
因为目的基因自身也有ATG，而用NcoI酶切后与pET28a连接上后NcoI也会剩一个ATG，所以目的基因前面也有个ATG了， 翻译应该是从NcoI酶切剩下的ATG开始的吧，
如果在目的基因上ATG翻译之前，先终止一次的话，后面的目的基因还可以继续翻译吗？
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~不太可能 因为rbs后翻译已经起始并终止一次了 很难再在目的基因的atg处起始翻译
或者还有其他方法 让pET28a中Nco1酶切后剩的ATG不影响目的基因的表达？
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~可以设计引物让ncoI的atg是目的基因的atg吧，
请相关人才赶快指点一下哈！
谢谢！
你这种设计没有n端的his tag吧？
我想在目的基因上游加NcoI酶切位点（C/CATGG），把目的基因连到pET28a上。
因为目的基因自身也有ATG，而用NcoI酶切后与pET28a连接上后NcoI也会剩一个ATG，所以目的基因前面也有个ATG了， 翻译应该是从NcoI酶切剩下的ATG开始的吧，
如果在目的基因上ATG翻译之前，先终止一次的话，后面的目的基因还可以继续翻译吗？
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~不太可能 因为rbs后翻译已经起始并终止一次了
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~可以设计引物让ncoI的atg是目的基因的atg吧，
请相关人才赶快指点一下哈！
谢谢！
你这种设计没有n端的his tag吧？
14941065：
回复 MisakaMisaka 的帖子
但我的目的基因的ATG后跟的是CC，要是跟着G就好了~
但我的目的基因的ATG后跟的是CC，要是跟着G就好了~
MisakaMisaka：
回复 14941065 的帖子
n端连接个小短肽大多数情况不会影响蛋白活性
如果非要n端与天然目的蛋白完全一样，ncoI处atg为目的基因的atg，也是有构建的方法 会麻烦些 个人认为没必要
n端连接个小短肽大多数情况不会影响蛋白活性
如果非要n端与天然目的蛋白完全一样，ncoI处atg为目的基因的atg，也是有构建的方法 会麻烦些 个人认为没必要
14941065：
回复 MisakaMisaka 的帖子
如果让nco1的ATG为目的蛋白的ATG，并且不影响目的蛋白，请教是怎么构建？谢谢！
如果让nco1的ATG为目的蛋白的ATG，并且不影响目的蛋白，请教是怎么构建？谢谢！
MisakaMisaka：
可以用下面2种方法 不过ncoI位点都会消失。
1. ncoI的用同尾酶，fatI，/CATG
不过是4碱基的 容易出现在目的基因里 就不能用了
2.用平末端或一平一粘。载体ncoI酶切后 klenow补平 。目的基因在atg后面的c为5‘设计引物。
另一端可以平也可以粘。就是具体流程上会有区别。
如果双平端 记得载体去磷酸化 目的片段磷酸化
1. ncoI的用同尾酶，fatI，/CATG
2.用平末端或一平一粘。载体ncoI酶切后 klenow补平 。目的基因在atg后面的c为5‘设计引物。
如果双平端 记得载体去磷酸化
14941065：
先谢了~
jingxiu999：
感觉7楼的有点悬，如果要不表达ncoI的atg的话，可以用ncoI上游的酶切位点。然后在引物设计时在目的蛋白atg的n端添加rbs序列。这样也许可以只表达你的
目的蛋白
14941065：
回复 jingxiu999 的帖子
感觉这样会切掉一些调控序列，估计到时候表达不了~
感觉这样会切掉一些调控序列，估计到时候表达不了~
jingxiu999：
不会的啊，你只要在你设计引物时添加上rbs序列就好了。注意距离。
jingxiu999：
是啊。如果你目的基因序列短的话，可以直接人工合成，合成时加上rbs序列就可以了。我也是遇到了同样的问题
jingxiu999：
加我qq吧544654705，一起讨论啊。
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