一、实验类型

　　提高型实验

　　二、实验原理

　　LD各同工酶的一级结构和等电点不同，在一定条件下，使其在支持介质上分离。然后利用酶的催化反应进行显色；以乳酸钠作为底物，LD催化乳酸脱氢生成丙酮酸，同时使NAD+还原为NADH。吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）将NADH的氢传递给氯化碘代硝基四唑蓝，使其还原为紫红色的化合物。有LD活性的区带就会显紫红色，且颜色的深浅与酶活性呈正比，利用光密度仪或扫描仪可求出各同工酶的相对含量。

　　三、实验方法

　　材料：

　　巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.075），0.082mol/L巴比妥-盐酸缓冲液（pH8.2），10mmol/L已二胺四乙酸二钠溶液，5g/L缓冲琼脂糖凝胶，8g/L缓冲琼脂糖凝胶，底物-显色试剂，固定漂洗液。

　　方法：

　　1.制板取冰箱保存的5g/L缓冲琼脂糖凝胶一管，置沸水浴中加热融化。用吸管吸取已融化的凝胶液约6mL，均匀铺在干净的7.5cm×5cm玻片上，冷却凝固后，于凝胶板阴极端约1.0-1.5cm处，用滤纸吸去富余的水分，并将15μm加样孔的塑料条贴放在此处，去除加样孔周围的气泡。

　　2.加样根据LD总活力大小，用微量加样器加20-40μL血清于孔内。

　　3.电泳电压75-100V，电流16-20mA/板，电泳30-40min，待清蛋白部分泳动3-4cm即可。

　　4.显色在电泳结束前5-10min，将底物-显色液与沸水浴融化的8g/L缓冲琼脂糖凝胶，按4：5的比例混合，制成显色凝胶液，置50℃热水中备用，注意避光。

　　终止电泳后，取下凝胶板置于铝盒内，立即用滴管吸取显色凝胶约6mL，迅速滴加在凝胶板上，使其自然展开覆盖全板，待显色凝胶凝固后，加盖避光，铝盒在37℃水浴中保温1h。

　　5.固定和漂洗取出显色的凝胶板，浸入固定漂洗液中20-40min，直至背景无黄色为止，再于蒸馏水漂洗多次，每次10-15min。

　　四、实验结果判读

　　1.目视观察电泳条带由正极到负极依次为：LD1(H4)、LD2(H3M)、LD3(H2M2)、LD4(HM3)和LD5(M4)。按各区带呈色的深浅，比较LD各同工酶区带呈色强度的关系。正常人LD同工酶电泳图像上呈色深浅关系为LD2>LD1>LD3>LD4>LD5。

　　2.定量检测将各区带切开，分别装入试管中，加入400g/L尿素4mL，于沸水浴中加温5-10min，取出冷却后以570nm波长比色。空白管取大小相同但无同工酶区带的凝胶，用上述相同的方法处理。比色后根据各管吸光度计算各同工酶的百分率。

　　五、注意事项

　　1.红细胞中LD1与LD2活性很高，因此标本严禁溶血。

　　2.LD4与LD5对热很敏感，因此底物-显色液的温度不能超过50℃。

　　3.LD4与LD5对冷不稳定，容易失活，应采用新鲜标本测定。

　　4.PMS对光敏感，故底物-显色液须避光，否则显色后凝胶板背景颜色较深。