Roche的DIG RNA labelling Mix 大约8美元一个reaction。

一共做过三次。模板是pBS-Upd3用四种酶切：BamHI，BsteII，KpnI和XbaI。其中，BamHI和XbaI用T3 polymerase，BsteII和KpnI用T7 polymerase。

转录很简单，In a microcentrifuge tube, add:

Transcription Optimized 5X Buffer(Promega)            4µl

DTT, 100mM (Promega)                               2µl

Ribonuclease Inhibitor(40u/ul)                          1ul

10X DIG labeled NTP (Roche)                           2ul

DNA template, linearized (0.2–1.0µg/µl)                1µl

Phage RNA Polymerase(Promega)                       2ul units

Nuclease-Free Water to final volume of                 20µl

Incubate for 1 hour at 37°C.

没有切开的质粒不能作为体外转录的模板，所以，即使酶切不完全也没关系。但是如果模板里面有乙醇或者盐残留，会抑制转录。

42度十分钟内可以灭活T3和T7 polymerase。

第一次一共做了四管。BamHI和BsteII（大约300bp）没有用carbonate buffer水解，酒精沉淀后可见明显白色沉淀。KpnI和XbaI（大约1121bp）用carbonate buffer水解了12分钟，然后加入neutralization buffer，再乙醇沉淀，不见白色沉淀。不知道是否转录失败，还是在水解过程中被RNA酶消化掉了。抑制物是不太可能，buffer，polymerase等应该没问题，因为至少有两管可以看见白色沉淀。

因为我没有再体外转录完活电泳，所以无法判断转录是否成功。

第二次，为了防止线性化的质粒加错，我把两种（XbaI和KpnI）都加到一管里。这次只体外转录了XbaI和KpnI，电泳结果发现RNA浓度很高。大约是2微克每微升。水解，XbaI30分钟后水解很适当，KpnI则1.3kb处有一条带比较不易水解。觉得是形成了二聚体，或者二级结构的存在导致耐受水解。

第三次体外转录，只转录了KpnI。电泳，用了一两周前的minigel，结果部分降解。这次，先把转录产物在80度加热10分钟，然后冰上骤冷，使之变性。再水解30分钟。

常见问题？没有遇到什么问题。觉得只要是各种solution是好的就可以。如果转录失败，可能原因：
1. 模板与polymerase不合导致缺乏相应的promoter。
2. 模板乙醇和盐或者其它物质残留，导致抑制转录。