2011.8.13补充：原来我提取的质粒总是耐受酶切的根源是用来配solution II的NaOH浓度过高。瓶上标记的浓度可能不对，或者是我加的量错了。

读研阶段是由一次一次的失败串联起来的。每一次失败，都告诉我一个道理。所以，我应该记下每一次失败。

这次做原位杂交，亚克隆做好之后要酶切，线性化质粒，作为体外转录的模板。结果，总是切不干净。一个小时后95%左右的都切开了，过夜继续切，那5%的残留还是切不开。既然大部分质粒能切开，那么，说明酶和buffer是没有问题的。为什么就有一少部分切不开呢？

后来从网上看到说是变性超螺旋质粒。在电泳时，速度比正常超螺旋质粒要快一点。但是，有些网页说对酶切是没有影响的，有些说有影响。

变性超螺旋是怎样产生的呢？我想，是加入碱性裂解液后时间过长，导致超螺旋质粒解开双链，同时操作不够轻柔，在复性过程中配对错误而产生的。于是，重提质粒，注意了前面几步加入solution I II III后操作轻柔。结果，还是部分耐受酶切。这一次，也许是solution的量不够：我一管里面沉淀了3毫升的菌液，且菌块很大，只加了1.5倍体积的solution。

我还怀疑是否有两个质粒：一个是pBS，一个是pBS-Upd3.但是，比较了线性化的pBS和那个切不开的片段，发现大小不一样，否定了这个假设。

后来，从Qiagen网站和维基百科上看到说明，说变性超螺旋是耐受酶切的，产生原因是碱裂解时间过长，产生错误配对。这两个网站都很可靠。终于相信了是变性超螺旋质粒。

由于认识到超螺旋质粒在体外转录时不会作为模板，就没管这个问题了。

下次，也许可以试试mini kit提取质粒，也许可以防止变性超螺旋质粒的产生。（2011.8.13补充：Sigma的minikit，提取质粒没有变性超螺旋，但是产量太低，只有手工提的一半到三分之一）。