实验七 滤膜法测定生活饮用水中的总大肠菌群

    一、实验目的

    1.掌握微生物检测水样抽滤作业流程。

    2.学会品红亚硫酸钠培养基等培养基的配制。

3.测定生活饮用水中的总大肠菌群。

二、实验原理

总大肠菌群滤膜法是指用孔径为0.45um的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在添加乳糖的选择性培养基上37℃培养24h，能形成特征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌以检测水中总大肠菌群的方法。

三、主要试剂和仪器

1.品红亚硫酸钠培养基。

2.乳糖蛋白胨培养液。

3.滤器。

4.滤膜，孔径0.45um。

5.抽滤设备。

6.1ml刻度吸管。

7.平皿：直径为9厘米。

8.无齿镊子。

9.酒精灯、酒精棉球。

10.培养箱：36℃±1℃。

四、检验步骤

1.消毒抽滤器：用一次性酒精棉球灼烧抽滤器，抽滤器每一个可能接触到水样的地方都应该用火焰外焰至少烧一遍。在灼烧过程中，当棉球表面出现黑色棉絮状时，将棉球用专门的平皿盖灭，丢弃。消毒的抽滤器数量与水样一致。

2.放滤膜：把将要伸入装滤膜瓶的镊子部分用酒精灯外焰灼烧2-3次，小心夹取滤膜边缘部分，放在抽滤平台正中，将滤器旋紧。此时抽滤器阀门、真空泵排气、排水阀应该都是关闭的（皆处于水平位置）。

3.水样抽滤：在平皿底部预留放置滤膜的位置写上对应水样编号，每个抽滤器中倒入相对应的已经混合均匀的水样，水样量依照标准规定。放完水样后，开真空泵电源，打开抽滤器阀门（扳到竖直），开始抽滤。

4.抽滤完毕：观察抽滤情况，抽完再抽滤10s(不可太久以防滤膜干裂)，关闭滤器阀门（扳到水平）。所有的水样抽滤完后，开真空泵的排气阀门放气（扳到竖直），关闭真空泵电源，开排水阀排水（扳到竖直）。

5.取滤膜：旋下抽滤器，用酒精灯外焰灼烧镊子尖端几秒以灭菌，在空气中冷却几秒后夹住滤膜边缘，移放在对应的培养基表面，滤膜截留细菌面向上，滤膜与培养基完全贴紧，中间不要有气泡，将平皿倒置（培养基面在上），放入对应温度的培养箱内培养。

6.整理工作：熄灭酒精灯，整理好台上物品，倒掉废水，填写环境温湿度记录。

五、数据记录与处理

饮用水总大肠菌群检验原始记录

C：出厂水

G：官网水

内控指标：出厂水：不得检出

          管网水：不得检出

    计算公式：

          总大肠菌群菌落数（CFU/100mL）=  数出的总大肠菌群菌落数×100

                                                过滤的水样体积（mL）

    注意：若出现符合下列特征菌落要进行革兰氏染色、镜检：

1.紫红色、具有金属光泽的菌落；

2.深红色、不带或略带金属光泽的菌落；

3.深红色、中心色较深的菌落。

六、讨论

自来水公司日分析用滤膜法测定生活饮用水中的总大肠菌群时，所用的水样量一般为100mL，但是根据水样量的不同操作也有所不同：

1.水样量为100mL或330mL时，直接将水样倒入消毒过的滤器中抽滤。

2.水样量≤10.0mL时，应当先在滤器中放入少量灭菌蒸馏水，再放入水样，以使水样中的菌能均匀分布在滤膜上。

3.水样量＜1.0mL时，应当先按规定稀释。如：需抽滤0.1mL水样，必须先取1mL水样注入到9mL灭菌生理盐水管中，混匀后从此管中吸取1mL即为0.1mL水样。依次类推。再按1步骤操作。