曲妥珠单抗耐药的研究进展

军事医学科学院附属医院乳腺肿瘤科   边 莉，江泽飞

曲妥珠单抗单药治疗HER -2 阳性晚期乳腺癌有效率仅为20％一30％，联合紫杉类药物治疗的有效率最高仅60 % ，中位疾病进展时间（TTP ）最长为10 . 6 个月，有40％患者初始治疗无效以及初始治疗有效的患者也在应用一段时间后出现疾病进展，深入探索曲妥珠单抗的体内作用以及耐药机制，争取进一步提高药物疗效。

曲妥珠单抗耐药机制的主要研究

2001 年Albanell 等首次提出“曲妥珠单抗耐药”概念，表明IGF -IR 信号通路抑制p27 , ，导致曲妥珠单抗对肿瘤生长抑制作用减弱，参与形成曲妥珠单抗耐药。此后的曲妥珠单抗耐药机制研究很多，主要结果有：( 1 ) PI3 K/Akt 信号通路过度活化，包括肿瘤抑制因子PTEN 表达缺失或PI3K 突变表达增高 ，以及HER -2 空间结构改变导致曲妥珠单抗与HER -2 结合受阻，包括p95 HER 一2 表达增高或粘蛋白4 ( Muc4 ）位阻。（2 ）细胞周期中增殖启动。Akt 信号通路活化，增强p27 磷酸化，导致其从细胞核易位至细胞质，从而阻断其与CDK2 / cyclin E1的相互作用，造成CDK2 / cyclin E1 释放，诱导细胞周期中增殖启动。2011 年scaltriti 等 通过全基因组分析的研究方法发现曲妥珠单抗耐药细胞中cyclin E 基因扩增，临床检测CyClin E 基因扩增患者与无扩增患者相比，曲妥珠单抗治疗获益率低。通过基因敲除或应用CDK2 抑制剂抑制耐药细胞克隆cydinE 活性，导致细胞增殖显著降低，细胞凋亡增强，说明曲妥珠单抗耐药形成过程中cyclin E过表达导致cDK2 活化，在HER -2 和cyclinE 过表达乳腺癌中应用CDK2抑制剂可能是一个有效策略。（3 ）免疫机制改变：① 免疫细胞Fc丫受体多态性影响曲妥珠单抗FC区域与之结合；② NK 细胞杀伤抑制受体（KIR ）表达增强，抑制NK 活性；③ 肿瘤细胞释放细胞因子发挥免疫抑制作用；④ 肿瘤表达抗凋亡蛋自BH3 家族从而对抗细胞毒淋巴细胞或NK 细胞介导的凋亡。（4 ）乳腺癌干细胞导致耐药。肿瘤干细胞被认为是造成肿瘤复发的原因之一。研究表明乳腺癌干细胞的某些改变，如PTEN 缺失、P13K 突变、NF 一KB 通路活化以及Notch 或Wflt信号通路的作用造成曲妥珠单抗治疗敏感性降低。

此外，2008 年shattuck 等研究发现部分HER -2 过表达乳腺癌细胞表达肝细胞生长因子受体Met，并且在曲妥珠单抗治疗后迅速上调Met 受体表达，Met 抑制p27 功能，导致曲妥珠单抗治疗无效。受体活化后通过Met 受体活化遏制乳腺癌细胞对曲妥珠单抗治疗原发敏感性，促进耐药形成，提示HER -2阳性患者某个亚群可能从联合抑制HER -2和Met 治疗中获益。2010 年Huang 等发现曲妥珠单抗耐药细胞中出现IGF -IR 与HER -2 或HER -3的异源二聚体，同时亦存在HER -2 与HER -3 异源二聚体以及这3 个受体形成的异源三聚体复合物，导致下游信号通路活化增强。反之，通过短发夹RNA 方法敲除HER -3 或IGF -lR 基因表达后，P²⁷表达上调，下游信号通路活性下降，恢复耐药细胞对曲妥珠单抗的敏感性。因此，联合抑制HER -3 、HER -2 和IGF –IR可能成为克服曲妥珠单抗耐药的治疗策略。

曲妥珠单抗原发与继发耐药的临床定义

2011 年Wong 等提出曲妥珠单抗耐药的临床定义为：在复发转移性乳腺癌中一线曲妥珠单抗治疗8 -12 周，或治疗后3 个月内疾病进展以及辅助曲妥珠单抗治疗过程中，或治疗结束后12 个月内，出现复发。我们对本院HER -2 阳性复发转移性乳腺癌患者接受曲妥珠单抗治疗的临床数据资料进行总结分析，在此基础上从临床角度分别定义如下：原发耐药定义为患者接受曲妥珠单抗初始治疗（12 周及以内）出现疾病进展；继发耐药定义为患者接受曲妥珠单抗初始治疗疾病得到控制（CR 、PR 、SD ) ，在治疗过程中( > 12 周）出现疾病进展。
曲妥珠单抗原发耐药的分子机制研究

2009 年Narayan 等报道对曲妥珠单抗不敏感的5 种HER 一2 阳性乳腺癌细胞系MDA 一MB - 361 、MDA 一MB453 、T47D 、UACCSIZ 以及UACC893 作为原发耐药的细胞模型，在含有曲妥珠单抗培养基中培养12 周后发现原发耐药细胞中3 种表皮生长因子受体( EGFR）表达增高，5 种HER-3 表达均增高，表明曲妥珠单抗原发耐药并不等同于曲妥珠单抗无作用，原发耐药细胞继续暴露于曲妥珠单抗将诱发HER 受体酪氨酸激酶表达重排。EGFR 表达增高的3 种耐药细胞中的2 种表现出对EGFR 抑制剂吉非替尼或西妥昔单抗的原发敏感性，表明曲妥珠单抗原发耐药乳腺癌细胞长期暴露于曲妥珠单抗将诱发HER 受体重排，随之发生HER 受体轴功能改变，而且暴露出新的治疗靶点如EGFR。从另一方面理解，曲妥珠单抗敏感HER -2 阳性乳腺癌细胞系中HER -2 功能类似癌基因，而曲妥珠单抗原发耐药细胞HER -2 表型可能与其他基因突变共分离，如果能够识别这种突变模式，可以预测曲妥珠单抗治疗后哪些患者对HER 靶向治疗敏感。上述研究提示部分HER -2 阳性患者其疾病呈现原发非HER-2 依赖性，这可能是曲妥珠单抗治疗原发耐药发生的主要机制。

曲妥珠单抗继发耐药的分子机制研究

重要一项是2007 年Ritte 等报道，将BT474 乳腺癌细胞接种裸鼠形成肿瘤，经曲妥珠单抗治疗后肿瘤消失，之后持续给予曲妥珠单抗治疗，直至肿瘤复发后成为继发耐药细胞，这些耐药细胞保持HER -2 基因过表达以及曲妥珠单抗结合位点。耐药细胞中磷酸化EGFR和EGFR/HER -2 异二聚体表达水平增高，并且过表达ECFR 、TGF -α、肝素结合的表皮生长因子（EGF）以及神经生长因子RNA ( heregulin RNA ) ，表明EGFR介导的HER-2活化增强。因此，研究者推测该过程中HER-2仍是EGFR 信号通路的放大器，因此直接抑制HER-2仍然有效。进一步研究表明，耐药细胞HER -2磷酸化可以被EGFR酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼和吉非替尼抑制，吉非替尼能够抑制耐药细胞p85与磷酸化HER 一3 结合，厄洛替尼能够体内抑制第5 代耐药细胞异体接种形成的肿瘤，吉非替尼、厄洛替尼以及拉帕替尼均能够诱导耐药细胞凋亡。上述结果表明：( 1 ）耐药细胞仍然依赖HER 受体作用通路；( 2 ）配体分导的HER 受体活化、扩增可能是曲妥珠单抗继发耐药形成机制；( 3 ）联合抑制EGFR 和HER 一2 对于治疗HER 一2 过表达的乳腺癌或延迟继发耐药出现可能具有协同作用。

2010 年的一项研究结果也认为曲妥珠单抗继发耐药与HER 配体导致的信号通路活化相关。有人评估曲妥珠单抗对多种信号通路作用，探索其在不同HER -2 阳性乳腺癌细胞系以及BT474 接种动物肿瘤模型中发生继发耐药机制。结果显示，尽管曲妥珠单抗下调HER-2受体表达，但并不降低HER -2 磷酸化水平；EGFR、HER -3 和HER-4通过与HER -2 形成二聚体而活化以维持HER -2 磷酸化水平，EGFR 、HER -3 和HER-4 的活化由HER 配体（包括神经生长因子和B 细胞生长因子）释放引发，HER 配体释放由ADAM 蛋白酶（ADAM17 / TACE ）介导。进一步发现，曲妥珠单抗治疗介导的PKB 磷酸化水平降低导致HER 配体与ADAM 蛋白酶之间的反馈通路活化，同时还发现曲妥珠单抗导致这个反馈通路激活HER 受体并维持HER-2磷酸化。研究证实，曲妥珠单抗治疗后ADAM 蛋自酶与HER 配体之间的反馈通路上调，导致曲妥珠单抗单药治疗疗效低，这可能是曲妥珠单抗继发耐药机制的新发现。因此该研究者提出，曲妥珠单抗联合另外一种HER 抑制剂对肿瘤抑制作用可能比单独使用曲妥珠单抗更显著。

上述两项研究提示，部分HER-2阳性患者在曲妥珠单抗治疗过程中由HER -2 依赖性向不完全依赖性转变，可能参与了曲妥珠单抗继发耐药形成。此外，下述几项研究也分别从不同角度对曲妥珠单抗继发耐药机制进行揭示。

自体吞噬是一种细胞保护机制，在代谢性应激和缺氧条件下促进肿瘤细胞生存。2009 年Vazquez - Martin 等评估曲妥珠单抗继发耐药乳腺癌细胞的自体吞噬作用，首先应用荧光显微镜发现曲妥珠单抗耐药SKBR3 细胞中自体吞噬标记物LC3 较敏感细胞显著增高。免疫印迹方法证实耐药细胞中LC3 脂质产物累积至高水平，并伴随着p62 / sequestosome 一l 蛋白表达降低。反之，通过。iRNA 方法敲除LC3 基因表达导致耐药细胞增殖能力下降，对曲妥珠单抗敏感性增加。表明HER-2过表达乳腺癌细胞长期暴露于曲妥珠单抗后出现自体吞噬活性上调，从而有效保护乳腺癌细胞逃避曲妥珠单抗的生长抑制作用，形成曲妥珠单抗耐药。因此，抑制自噬体形成和功能可能成为减少曲妥珠单抗耐药出现的新途径。
    t 一DarPP 是磷酸酶抑制子Darpp 一32截断后的一种形式，其过度表达使肿瘤细胞抗凋亡能力增强。2009 年有人发现曲妥珠单抗耐药细胞中Darpp -32表达并没有增强，只是t 一Darpp 过度表达。反之，将 t 一DarPP  和DarPp 一32 基因转人HER 一2 阳性的SKBr3 细胞中，发现转染t 一DarPp 基因的细胞获得耐药性，而与Darpp 一32 共转染能够抑制t 一DarPP 介导的耐药性。2010 年Hamel 等对HER -2 阳性曲妥珠单抗继发耐药乳腺癌细胞系BT474 亚克隆进行基因表达检测，发现PPPI RIB 基因过表达，编码Dar pp 一32 ，而Western blotting 检测仅显示Darpp 一32蛋白截断亚型t 一Darpp 过表达。基因沉默方法证实  t 一DarPP 过表达的确与曲妥珠单抗耐药相关。进一步研究发现t 一DarPP过表达与Akt活化相关，t 一Darpp 中的T75 残基是造成Akt 活化和曲妥珠单抗继发耐药形成的原因。
    尽管上述研究均试图从某一个角度对曲妥珠单抗原发耐药或继发耐药的机制进行揭示，然而其发生机制绝非来自于单一因素，可能是多因素复合的结果，需要我们进一步探索。目前在曲妥珠单抗治疗中，我们应该根据不同的临床耐药患者亚群给予不同临床治疗策略，对于曲妥珠单抗初始治疗无效的患者应早期给予更换药物治疗，可以换用拉帕替尼，并可以按照文献研究结果试用西妥昔单抗或EGFR 抑制剂厄洛替尼／吉非替尼。对于在治疗过程中出现疾病进展患者可以换用其他化疗药物继续联合曲妥珠单抗，使患者最大限度从曲妥珠单抗治疗中获益；或者在曲妥珠单抗治疗的基础上联合拉帕替尼进行双重靶向治疗。