第八章基因克隆

基因克隆（gene cloning ）或分子克隆,又称为重组ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA 分子的过程。
克隆（clone）一指含有单一的DNA 重组体的无性繁殖系，或指将DNA 重组体引入宿主细
胞建立无性繁殖系的过程(cloning) 。
一个完整的基因克隆过程包括以下步骤：
１、获得待克隆的DNA 片段（基因）；
２、目的基因与载体在体外连接；
３、重组DNA 分子导入宿主细胞；
４、筛选、鉴定阳性重组子；
５、重组子的扩增与／或表达。

第一节重组DNA 中常用的工具酶

包括限制性核酸内切酶、DNA 连接酶、DNA 聚合酶、逆转录酶等，
一、限制性内切酶的定义、命名和分类
限制性核酸内切酶是识别并切割特异的双链DNA 序列的一种内切核酸酶。
限制性核酸内切酶的来源：细菌的限制－修饰系统。
分子克隆中所用的限制性核酸内切酶属于第Ⅱ类。
限制性核酸内切酶的命名。
二、限制性核酸内切酶的作用特点
1、识别位点的DNA 序列呈二重旋转对称（即具有迥文结构）；
2、切割DNA 均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端；
3、错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA 产生平头末
端，也称钝性末端。
4、少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点，这些酶称为同切酶，如MboI Ⅰ和 Sau3A 。
三、其它工具酶
参考“分子克隆”（Sambrook,J et al . molecular cloning）

第二节载体－宿主系统
一、概述
载体(vector) 是携带外源DNA 进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA,它们一般是通过改造质
粒、噬菌体或病毒等构建的。
载体应具备以下条件：
１、能在适当的宿主细胞中复制；
２、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA 插入；
３、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；
４、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA 与宿主DNA 便于分离；
５、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达
元件。
宿主细胞是基因克隆中重组DNA 分子的繁殖场所，适当的宿主细胞，必须符以下条件：
１、对载体的复制和扩增没有严格的限制；
２、不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；
３、在重组DNA 增殖过程中，不会对它进行修饰；
４、重组缺陷型，不会产生体内重组；
５、容易导入重组DNA 分子；
６、符合重组DNA 操作的安全标准。
二、质粒载体
质粒(plasmid) 是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA 分子，能自主复制，并在
细胞分裂时遗传给子代细胞。质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状如抗药性等，通过质粒赋予
细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选重组转化子的基础。
作为载体的质粒一般具有以下特点：
１、分子相对较小（３∽１０kb）；
２、松驰型复制；
３、具有适当的多克隆位点以便外源DNA 插入；
４、具有插入失活筛选标志，便于从平板上直接筛选阳性重组子；
５、质粒能携带的外源DNA 片段一般较小（<15kb）．
三、λ噬菌体载体
λ噬菌体是一种双链DNA 噬菌体，基因组约为50kb+ 。
线性λ噬菌体DNA 分子的两端各有12 碱基的互补单链序列，是天然的粘性末端，称为COS
位点。
λ噬菌体的生活周期：溶菌（裂解）生长时在平皿上形成清亮的噬菌斑；溶源性生长。
λ噬菌体的基因组：左臂长约20kb, 含噬菌体头、尾蛋白编码基因；中央片段长约12-24kb,
对噬菌体为非必需区；右臂长约10kb, 含λ噬菌体复制和溶菌相关蛋白的编码基因。所有λ
噬菌体载体均为通过切除非必需的中央区，并增减某些限制性酶切位点和插入适当的筛选标
记基因改造而成。
已构建的λ噬菌体载体分为两类：
１、置换型载体：有两个酶切位点或两组排列相反的多克隆位点，其间的DNA 片段可被外
源DNA 置换。这类载体适于克隆5-20kb 的外源基因片段，常用于构建基因组DNA 文库。
２、插入型载体：只有一个限制性内切酶位点或一组多克隆位点可供外源基因插入。这类载
体允许插入5-7kb 的外源DNA,适于构建cDNA 文库。如λgt
噬菌体载体。
一般将噬菌体DNA 在体外包装成病毒颗粒后再用于感染受体菌，这样能大大提高转染效率。
四、Ｍ13 丝状噬菌体载体
Ｍ13 基因组大小为6407bp ，它是一种闭环的单链DNA 分子，在感染细菌后呈双链复制型
DNA。因此用作克隆载体的双链DNA 可从细菌中分离得到。在细菌中，双链DNA 复制
100-200 拷贝后就大量产生单链DNA,后者包装成子代噬菌体颗粒，分泌到细胞外，而不裂
解细菌。
在M13 基因组中含507 个核苷酸的非必需区，在这个区域插入外源DNA 不会影响M13 的
繁殖和生存，现在使用的M13 载体如M13Mp18 等均为对此区域进行改造而获得。
M13 克隆的最大问题是不能插入较大的外源ＤＮＡ片段（一般<1000bp）,但M13 载体的优
点是从细菌中释放出来的噬菌体颗粒中含有一条与克隆的模板DNA 互补的单链，所以最适
合于制备DNA 测序时用的单链模板，另外也可用于制备单链特异性DNA 探针。
五、粘粒载体
粘粒（柯斯质粒）是指含有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由λDNA 的COS 区(约20-数百
bp)与质粒重组而成，在宿主细胞中可作为正常噬菌体进行复制，但不表达任何噬菌体的功
能。
粘粒的结构特点：
１、含有抗药性标记和质粒复制起始位点；
２、一个或多个单一限制酶切位点；
３、带有λ噬菌体粘性末端；
４、分子小（4-6kb）,可容纳大到40-50kb 的外源DNA 片段，因此适于构建真核生物基因
组DNA 文库。
六、酵母人工染色体载体
酵母人工染色体由酵母染色体的着丝粒(cen4) 、自主复制序列(ARS1)和来自四膜虫的端粒
(Tel) 等功能性DNA 序列组成。它可携带长达200-1000kb 的DNA 片段，因此在人基因组
DNA 大片段的克隆中非常有用，是染色体克隆排序的主要工具。
用酵母人工染色体克隆DNA 的过程与λ噬菌体相似，将DNA 大片段与载体的两臂相联，
然后将连接混合物转化进酵母细胞中，利用载体上的选择性标记进行筛选。

第三节目的基因的获取
一、通过建立基因文库分离靶基因
基因文库包括两类：基因组文库和cDNA 文库，两种文库的建库过程不同，产生的基因结
构也不同，因此应用范围也不相同。
（一）、基因组文库
是含有某种生物体（或组织、细胞）全部基因的随机片段的重组DNA 克隆群体。
用λ噬菌体载体构建基因组文库的基本步骤：
１、准备载体DNA(如置换型λ噬菌体载体)，用适当的限制酶消化并分离得到载体的左右
两臂；
２、纯化真核细胞高分子量DNA，并用适当的限制酶部分消化；
３、分离适当大小的基因组DNA 片段（20-24kb）；
４、连接载体与外源ＤＮＡ；
５、连接产物体外包装及感染；
６、基因组文库的扩增。
由于基因组文库包含了染色体的所有随机片段形成的重组DNA 克隆，因此，利用适当的筛
选方法，就可以从中找出携带所需目的基因片段的重组克隆。
（二）、cDNA 文库
cDNA 是指以mRNA 为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补DNA.
以细胞的全部mRNA 逆转录合成的cDNA 组成的重组克隆群体称为cDNA 文库。
从cDNA 文库可以获得较完整的连续编码序列（不含内含子），便于表达成蛋白质。
构建cDNA 文库的主要步骤：
１、 mRNA 分离；
２、 cDNA 第一链合成；
３、 cDNA 第二链合成；
４、载体与cDNA 的连接;
５、噬菌体的包装及转染；
６、 cDNA 文库的扩增和保存。
二、化学合成法制备DNA 片段
主要用于一些小的DNA 片段的合成。
三、聚合酶链反应法扩增基因片段
对于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通过聚合酶链反应（ＰＣＲ），以基因组DNA
或cDNA 模板扩增得到目的基因片段。

第四节 DNA 分子的体外连接
DNA 片段的体外连接是重组DNA 技术的关键。DNA 连接是由DNA 连接酶催化完成的。
一、DNA 连接酶
DNA 连接酶催化两年双链DNA 片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。
在分子克隆中最有用的的DNA 连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA 连接酶，
该酶需要ATP 作为辅助因子。
T4 DNA 连接酶在分子克隆中主要用于：
１、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；
２、连接双链DNA 分子间的平端；
３、在双链平端的DNA 分子上添加合成的人工接头或适配子。
二、粘性末端连接
如果载体和插入片段具有相同的粘性末端，则很容易用DNA 连接酶连接成环状的重组DNA
分子，但是要注意当载体和插入的两个末端均为同源的粘性末端时，连接后可能出现以下问
题：
１、载体自身环化，造成假阳性背景克隆，为避免此问题，可在连接前，用碱性磷酸酶将
载体DNA 5’-端去磷酸化，这样只有载体和插入片段之间才能发生连接；
２、插入片段可双向插入；
３、插入片段可多拷贝插入。
当DNA 片段两端为非同源的粘性末端时，可实现定向克隆，这时的连接效率非常高，是重
组方案中最有效、简捷的途径。
三、平端连接
平端连接的优点是可用T4 连接酶连接任何DNA 平端，这对不同DNA 分子的连接十分有利。
因为除了相同或不同限制酶酶切产生的平末端分子外，含3’-或5’-突出的粘性末端也可
以被补齐或削平，实现平端连接。
（一）、5’-突出粘性末端的补齐
限制酶降解产生的5’-端突出的粘性末端，可用大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ的大片段（klenow
片段）补齐。
（二）、3’-突出粘性末端的削平
含3’-突出的粘性末端可用T4 DNA 聚合酶的3’→5’外切核酸酶活性补平。
平端连接的主要问题是，它的连接效率比粘性末端低，因此需较多的T4
DNA 连接酶和较高的底物浓度，聚乙二醇（ＰＥＧ）可促进平端连接反应。
四、人工接头连接
对平端DNA 片段，可借助人工合成的接头来方便连接。所谓接头是人工合成的至少８个核
苷酸长的一段迥文序列。接头是平端，在磷酸化后通过T4
DNA 连接酶可与大多数平端DNA 连接。连接后用相应的限制性内切酶切割，可产生所需
要的粘性末端。
五、利用适配子连接
适配子是人工合成的具有一个以上限制酶识别位点的短序列，它具有一个平端，可与其它
DNA 的平端连接，同时它还有某种限制酶的突出端，可与含互补的限制酶突出端的DNA
片段连接，连接后，用适当的限制酶切割又可产生所需要的突出粘端。
第五节重组DNA 导入宿主菌
体外连接的重组DNA 分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据
所采用的载体的性质，将重组DNA 分子导入受体可有不同的方法。
一、转化
指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。转化时，细菌必须经过适当的处理
使之处于感受态－即容易接受外源DNA 的状态，然后利用短暂热休克使DNA 导入细菌宿
主中。
此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。
二、转染和感染
利用噬菌体DNA 作为载体时可经两种方式导入受体菌。一种是感染，即在体外将噬菌体
DNA 包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。另一种方式是转染，即在DNA 连接酶作用
下使噬菌体DNA 环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA
为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。
第六节重组克隆的筛选与鉴定
基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正
确性。通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基
因的结构、功能，或表达该基因的产物。
一、抗药性标志的筛选
如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr 或tetrr
，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这
样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA 时将外源基因插入标志基因内，该标
志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，还可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落。
二、β－半乳糖苷酶系统筛选
很多载体都携带一段细菌的lacZ 基因，它编码β－半乳糖苷酶N-端的146 个氨基酸，称为
α－肽，载体转化的宿主细胞为lacZΔ15 基因型，它表达β－半乳糖苷酶的C-端肽链，当
载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特异的底物
X-gal变为兰色化合物，这就是所谓的α－互补，而重组子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互补，在含X-gal 的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。
三、菌落快速裂解鉴定法
从平板上直接挑选菌落裂解后，直接电泳检测载体质粒大小，判断有无插入片段存在，该法
适于插入片段较大的重组子初筛。
四、内切酶图谱鉴定
经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA,用相应的
内切酶切割，释放出插入片断；对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插
入的方向。
五、通过聚合酶链反应筛选重组子
一些载体的外源DNA 插入位点两侧存在特定的序列，如启动子序列等，利用这些特异性序
列作为引物，对小量制备的质粒DNA 进行聚合酶链反应（PCR）分析，不但可迅速扩增插
入片断，判断是否阳性重组子，还可直接对插入进行DNA
序列分析。
六、菌落或噬菌斑原位杂交
它是先将转化菌落或噬菌斑直接铺在硝酸纤维素膜或琼脂平板上，再转移至另一膜上，然后
用标记的特异DNA 探针进行分子杂交，挑选阳性菌落。该法能进行大规模操作，一次可筛
选多达5x105-5x106 个菌落或噬菌斑，特别适于从基因文库中挑选目的基因。