犬钩端螺旋体病诊断检测见下表，确诊常基于急性期和恢复期血清学检测。

暗视野显微镜检查

暗视野显微镜检查尿沉渣对诊断钩端螺旋体病来说并不敏感，需要相当的经验精确识别钩端螺旋体，假阳性可能发生。

培养

钩端螺旋体培养不常进行，因为培养很慢且不敏感，所以未被广泛使用。培养需要特定钩端螺旋体生长培养基，诸如Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris(EMJH)培养基。培养需耗时高达3~6月，如果培养被污染，其它细菌可过度生长。抗生素开始治疗前，需用无菌技术采集静脉血和/或尿液。理想情况下，采集几滴血或尿液直接加入身边的培养基进行培养。在人医，发热初期采集的血液最好；发病一周后进行尿液采集。因为感染的确切时间不清楚，采集血液和尿液送检可增加阳性检测结果几率。

仅仅某些特定参考实验室能培养钩端螺旋体，能识别各种血清型的钩端螺旋体，后者需要进行交叉凝集素吸收试验。尽管培养和识别钩端螺旋体有很多困难，但是钩端螺旋体病流行性研究还是要依赖这些方法。

血清学诊断

目前，钩端螺旋体病确诊是使用显微镜凝集试验（MAT）的血清学检测方法。实验室将动物血清与一组钩端螺旋体血清型混合，然后报告每个待检血清型的凝集抗体滴度，使有机物凝集的最高倍稀释血清进行暗视野显微镜评估。血清阳性的犬多种血清型抗体滴度均很高，这是因为不同血清型间具有交叉反应，最高的抗体滴度并不能判断为感染的血清型。在疾病过程中，血清学检测最高抗体滴度的血清型可能发生变化。

使用MAT法确诊至少需要一个血清型抗体滴度4倍或更高的增长，因为疾病前几天抗体滴度经常很低或阴性，单个高抗体滴度可源于先前感染或进行钩端螺旋体免疫。疾病后期，抗体滴度降低4倍也可用于确诊。尽管在感染后3~5天即可产生抗体，但传统上来说，急性感染后2~4周进行恢复期抗体滴度检测。然而，连续的抗体滴度检测应该间隔至少1周，且必须使用同一实验室同样的滴度设定。抗生素治疗能阻碍抗体滴度增长，但对于犬，即使使用抗生素治疗通常也可产生血清转换。先前疫苗免疫、暴露或长期感染所产生抗体滴度通常在一倍稀释程度内变化（例如，从1:400至1:800）或保持稳定。自然感染抗体滴度持续至少1年，不过疫苗免疫抗体滴度经常在4月后下降。然而，免疫后抗体滴度可持效超过1年，且能维持很高的水平（≧1600），特别是持续接触当地菌株时。所以，单个菌株抗体阳性支持怀疑患病，但不能用于确诊钩端螺旋体病。免疫后，除了疫苗中的血清型，其它血清型由于交叉反应也可出现抗体阳性，所以免疫犬疫苗中未含有的血清型抗体滴度阳性并不能表明出现了自然感染。

如果感染的血清型（或相关的血清型）不在受检血清型之列，试验结果可出现假阴性。人钩端螺旋体病确诊试验通常包括许多血清型（>20），多于兽医诊断筛查范围（5~7个血清型）。理想情况下，试验应该包括流行于当地犬中血清群的血清型，即使这一信息经常不容易获得。

MAT应用广泛，价格相对较低，不过试验和判读复杂。因为使用的是活的致病性血清型且难以标准化，试验对实验室工作人员存在危险。根据报道的抗体滴度和每个血清型血清反应性特征，检测结果存在实验室间变异。试验中血清型必须经常进行验证，确保未出现交叉污染或培养衰退。钩端螺旋体病技术检查图表由国际钩端螺旋体病协会（ILS）提供，以帮助实验室维持MAT质控。兽医应该尽量使用参与质控图表的实验室。

钩端螺旋体病调查其它血清学确诊试验包括检测IgG和IgM抗体的ELISA实验，检测钩端螺旋体表面抗原。根据当地钩端螺旋体血清型不同，这些试验存在地域差异。在欧洲，横向流实验检测IgM（Test-it, Royal Tropical Institute/Life Assay Diagnostics）可用于诊断犬急性钩端螺旋体病。这一实验对于确诊犬钩端螺旋体病具有高的临床敏感性，在荷兰（100%），在西印度群岛（78%）；来自于荷兰、西印度群岛和墨西哥的报道显示健康犬的假阳性率低（<5%）。

使用聚合酶链反应（PCR）的分子学诊断

美国和欧洲几个实验室提供PCR试验，检测血液和/或尿液中的致病性钩端螺旋体DNA。犬钩端螺旋体病这些试验的敏感性和特异性仍未完全评估，可能存在地区性差异，因为不同的血清型排泌模式有所不同。不同实验室在试验的进行方面也可能存在差异。疾病早期，PCR试验对于确诊有一定优势，此时血清学检测为阴性，或犬仍具有免疫后的残存抗体。PCR检测的样本最好在开始抗生素药物治疗前采集，血液和尿液均送检以增加敏感性。阴性结果并不能排除钩端螺旋体病。因为亚临床感染的犬能排泌钩端螺旋体，尿液PCR检测阳性可能不表现出疾病状态。钩端螺旋体灭活苗免疫的健康犬并不会导致PCR检测阳性，所以钩端螺旋体免疫病史不会干扰PCR诊断。目前，可用的PCR试验不提供感染的血清型或血清群方面的信息。