犬角膜组织学结构观察

http://s9/mw690/001Cp8GNzy7JWVuXss828&690

 

一．           摘要     

目的：  通过对犬角膜组织学结构进行观察，为临床进行犬角膜移植手术等工作积累数据和经验。

取材：实验用犬角膜来自中国农业大学动物医院临床病亡犬。

方法：  对犬角膜进行固定、脱水、透明、石蜡包埋和HE染色制得组织学切片，进行光镜观察。

关键词： 犬 角膜 HE染色 切片

abstract 

Objectives:  In order to accumulate datum and experience for further study, such as clinic operation of cornea transplant in canine, we observed the histological structure of  cornea.

Material:  The canine’s corneas for experiment came from the death or dying dogs of the China Agricultural University Veterinary Teaching Hospital.

Methods:  Following the process of fixation, dehydration, transparence, olefin embed and HE coloration, we get the histological lamina of canine, then we observe the structure of dog’s cornea by microscope.

Key words:  canine; cornea; HE coloration;

二．           综述

1. 角膜结构 角膜（cornea）约占眼球壁外层纤维膜的1/5，是眼球的第一道透光介质，呈透明的圆盘状，略向前方突出，边缘与巩膜相连。角膜的横断面上层次分明，从前至后共分5层（图 1）。

 

图1角膜 HE×200

（1）       角膜上皮（corneal epithelium）：为未角化的复层扁平上皮，细胞排列整齐，有5～6层。表层细胞游离面有许多短小的突起，浸浴在泪液膜中。上皮基部平坦，基底层细胞常见分裂像，表明角膜上皮更新较快，并有较强的再生能力。上皮内有丰富的游离神经末梢，因此感觉十分敏锐。角膜边缘的上皮渐增厚，基部凹凸不平，与球结膜的复层扁平上皮相延续（图2）。不同厚度的角膜上皮都含有基底细胞、翼状细胞和表层细胞。

    

图2 眼球前半部切面

（2）前界层（anterior limiting lamina or bowman’s membrane ）：为无细胞的均质层，由胶原原纤维和基质构成，具有一定的抗感染力。前界层在灵长类动物中很明显，但在其它动物上不明显。

（3）角膜基质（corneal stroma or substantia propria ）约占整个角膜厚度的90%，由大量与表面平行的胶原板层组成。每一板层含大量平行排列的胶原原纤维，纤维直径一致，约35nm；胶原原纤维之间充填粘多糖等成分。相邻板层的胶原纤维排列呈互相垂直的关系，板层之间的狭窄间隙中有扁平并具有细长分支突起的成纤维细胞（图3）。角膜基质不含血管，有大量的无髓神经纤维，其营养由房水和角膜缘的血管供应。上述角膜基质结构特点是角膜透明的重要因素。

 

图3角膜基质

左图 角膜基质电镜像示胶原板层×40000 右图 角膜基质结构立体模式图

（4）后界层（posterior limiting lamina or descemet’s membrane）：亦为一透明的均质膜，较前界层薄，也由胶原原纤维和基质组成。后界层由角膜内皮分泌形成，随年龄增长而增厚。后界层虽然是一薄层，但电子显微镜显示它是由非典型胶原组成的致密有序的三维结构。

（5）角膜内皮（corneal endothelium or mesenchymal epithelium ）：为单层扁平上皮。上皮细胞具有合成和分泌蛋白质的超微结构特点，胞质内还含有大量的线粒体和吞饮小泡，表明具有活跃的物质转运功能。角膜内皮细胞形态上与血管和淋巴管上的排列的内皮细胞不完全一致，角膜内皮包含大量磷状和低柱形细胞，这些细胞相反交错组成紧密的细胞层包围着角膜内壁，将角膜与眼房水分开。但是，眼前房的内皮与静脉丛的内皮是相连续的，通过这，眼房水进入体液循环。

 

   2. 切片制作 由于角膜组织结构致密、质地坚韧, 按常规制片方法很难制出理想的切片, 又由于火棉胶包埋虽然可避免纤维组织过度硬化, 减少纤维组织的收缩和扭曲, 有利于保持组织的原有构造，但此方法繁杂、费力、费时, 而且火棉胶包埋的组织块不易切成几微米厚的薄片。为了使角膜能被切成很薄的切片，便于观察和测量，我们选用常规的石蜡包埋切片法，改变各步所需时间，制作角膜切片。

 

三．           取材与切片制作

1.       材料实验用犬角膜来自中国农业大学动物医院临床病亡犬，选取眼部健康无病变的死犬，在犬主人允许或死犬已被主人遗弃的情况下，用手术刀和解剖剪在离角膜缘约3mm的巩膜上作环形切口，取下角膜，并使保留在角膜上的巩膜宽度均匀，防止角膜在固定和脱水等过程中变形，同时用丝线缝在角膜上12点处，作为标记，并在实验记录本上记录好角膜取自犬的品种、年龄、性别等，角膜固定时的上下位置及左右眼。

2.       制片过程

                  固定 将标记好的角膜固定于10%福尔马林中24小时，同时注意角膜在溶液中保持平整，防止角膜变形。

                  脱水 脱水方法按常规进行,具体要求如下。

a 先用70%乙醇脱水12小时。

b 再用80%乙醇脱水2小时。

c 再用90%乙醇脱水1小时。

d然后用95%乙醇脱水30分钟。

e最后用无水乙醇更换两次共脱水40分钟。

                  透明

a 无水乙醇 ：二甲苯 = 1 ：1 透明30分钟。

b二甲苯纯液透明20分钟。

c二甲苯纯液再透明20分钟。

                  浸蜡 角膜组织结构致密, 包埋剂(石蜡)不易透入。

a 先使用熔点为52～54的石蜡,浸蜡30分钟。

b 再使用石蜡(熔点54～56)浸蜡1小时。

c 最后再用石蜡(熔点56～58)浸蜡1小时。延长浸蜡的时间使石蜡充分均匀地渗入组织中,这样制成的蜡块硬度均匀,切片就能完整地切出。

                  包埋预先折好适当大小的纸盒，当浸蜡时间到时，把第三碗蜡作为包埋蜡，将浸过蜡的组织按顺序平整地放在纸盒中，同时倒入熔化的包埋蜡。这个过程要求操作迅速，即不能使石蜡凝固，而使包埋的石蜡块产生气泡；也不能让包埋蜡温度过高，以免角膜组织被烫坏或变硬变脆。包埋完组织块，将其放在平整的桌面自然冷却。并在记录本上记录好角膜的包埋时的位置。

                  制片

a 切片前的处理将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，组织四周留约2mm的石蜡边。留的过少，以后分片困难，并易于破坏组织；留得过多，徒占地方，又费刀。修完蜡后，将蜡块焊在平整的长方体木块上，并把木块固定在切片机上，装上切片刀，调整好切片刀的倾角（5—10度比较适合）。切片刀的倾角非常重要，倾角过小，组织块不能先与刀口接触，蜡块却先与刀刃边缘接触，使刀刃边缘撞击蜡块；当刀刃的倾角过大时，使刀口刮组织蜡块的表面，切片极易破碎。

b 切片操作切片机时，转速要均匀，转速不匀会使切片厚薄不等。根据需要每个角膜切片厚度取4µｍ、6µｍ、8µｍ三种，4ｕｍ用于观察角膜组织学结构，8µｍ用于角膜各点厚度，6µｍ用于对比。带状石蜡切片切完后将蜡带放在干净的平盘上准备粘片，同时作好记录。

c 粘片粘片的目的是将石蜡切片粘附在载玻片上，借水的张力和一定的温度，使略皱的蜡片伸展平整，以便染色、镜检。同时使用水捞法和干粘法，以作对比。粘好的切片在温箱内过夜烘干。

                  染色 角膜组织胶原原纤维丰富, 所以伊红染色时间要相对缩短,若染色时间过长会影响细胞核的染色与观察。苏木素的染色时间可适当延长, 否则细胞核内结构不清楚。

a 烘干后的石蜡切片经两次二甲苯纯液各20分钟，将切片上的石蜡脱净。

b 脱蜡后经无水乙醇及各级乙醇下行至水，100%、100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%乙醇各1分钟。

c 应用半氧化苏木素染色6分钟, 核内结构清晰透澈, 颜色鲜艳, 核浆对比鲜明。蒸馏水洗涤1----2分钟，入0.5%盐酸的70%酒精溶液分色30秒。分色后用自来水蓝化1分钟，使细胞核变成蓝色。

d 入50%、60%、70%、80%酒精各1分钟，开始置换组织中的水分。

e 入0.5%伊红的95%酒精溶液50秒。

f 入95%、100%、100%酒精各1分钟，彻底用酒精置换出组织中的水分。

g 再经两次二甲苯纯液各20分钟，使组织中充分进入不含水分的透明剂二甲苯。

h 取出切片，将组织周围多余的二甲苯擦去，滴树胶后加盖玻片封固。这个过程动作要迅速，因为二甲苯容易挥发。在玻片空白一侧贴上标签，作好标记。最后将封固好的切片水平放置凉干。

  

结果：细胞核蓝紫色，胶原纤维、胞浆桃红色，弹性纤维亮桃红色。

 

   

四．           结果与分析

 

实验结果相片：

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图1 犬角膜结构（6ｕｍ HE 10×10）

 

 

      成纤维细胞       胶原纤维       前界层        角膜上皮

           

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图2 犬角膜结构示角膜上皮（6ｕｍ HE 10×100）

 

 

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图3 犬角膜结构示上皮下基膜（6ｕｍ HE 10×40）

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图4犬角膜结构示基质层（6ｕｍ HE 10×40）

 

 

 

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图 5 犬角膜结构示后界层和内皮层（6ｕｍ HE 10×40）

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图 6 犬角膜结构示角膜缘（6ｕｍ HE 10×40）

 

                           

 

 

 

图7复层扁平上皮（与角膜上皮对比，角膜上皮为未角化的复层扁平上皮）

 

图8 毛细血管单层扁平上皮（与角膜内皮对比，角膜内皮也为单层扁平上皮）

 

结果分析： 为了使角膜能被切成很薄的切片，便于观察和测量，我们选用常规的石蜡包埋切片法制角膜切片。但角膜组织结构致密, 质地坚韧，经酒精脱水处理后纤维组织产生一定硬化, 甚至出现收缩和扭曲，而引起角膜变形。硬化的角膜在切片过程中对切片刀损坏严重。为了避免上述石蜡包埋切片法引起的问题，本实验与常规石蜡包埋切片法相比，减少了各梯度酒精脱水的时间，一定程度上克服了纤维组织过度硬化的问题。

 

五．           参考文献

1.       沈霞芬 滕可导主编。家畜组织学与胚胎学。2001年1月中国农业出版社出版。

2.       杜卓民主编。实用组织学技术。1982年3月人民卫生出版社出版。

3.       彭希平 乔从进。眼球教学切片制作方法的改进。山西医科大学学报2004年4月，33（2）

4.       邢　璐。皮肤病理切片制作的改进与提高。海南医学 2002年第13卷第4期

5.       陈穗桦等。角膜内皮细胞损伤后早期超微结构改变。医学研究生学报 2001年6月第14卷第3期

6.       贵阳医学院组织胚胎学教研组编。组织学图谱（显微镜彩色摄影）。1974年6月上海人民出版社出版。

7.       William J. Banks, Ph.D., D.V.M  Applied Veterinary Histology  Composed and printed at the Waverly Press, Inc. Mt. Royal and Guilford Aves. Baltimore, MD 21202, U.S.A.

 

六．           致谢

本实验是在齐长明教授和马忡师兄的悉心指导下完成的。齐老师对工作的兢兢业业以及对学生的关心给我留下了深刻的印象。马忡师兄在实验期间的认真指导，不仅使我学到很多知识，而且实验技能也得到了很好的锻炼，为今后的学习打下了良好的基础。

特别感谢院教务处的马老师，马老师在本实验准备阶段时，为我们详细讲解了切片制作过程。感谢马志斌、屠小嫱同学协助完成本实验。

值此之际，特向所有给予我指导和帮助的老师、同学以最衷心的感谢！