[转载]关于荧光补偿设置单染对照的三条原则

已有 1603 次阅读 2013-8-8 17:14 |个人分类:流式知识|系统分类:科研笔记|关键词:荧光补偿 单染对照

译者：FlowJo技术支持， 张庶

首先，同时也是最重要的是必须为同批次实验的每个荧光参数设置单染对照！

其次，有三条原则来判断荧光补偿单染对照选择的合适与否。

1.单染对照的荧光强度至少要与实验样本一致，或者要超过实验样本的荧光强度。

2.阳性和阴性的背景荧光强度应该一致。

3.补偿所用对照的荧光染料必需与当前实验所用的荧光染料一致。

下面我们分别来解释上述三条原则：

1. 单染对照的荧光强度至少要与实验样本一致，或者要超过实验样本的荧光强度。

一个重要的考虑是选择荧光强度最大的荧光染料来进行实验，而不要选择那些荧光强度较弱的荧光染料来进行实验。只有选择较强的荧光染料才能准确估测微量的荧光溢漏。例如，如果一个MFI为10,000的染料产生一个较弱的荧光溢漏，那么可能这样微弱的溢漏甚至不能超过细胞的自发荧光（或者本底荧光），这样系统就会认为不需要进行补偿。如果是一个MFI为100,000的染料所产生的荧光溢漏，那就会非常明显，继而系统就能准确地计算出补偿值。补偿仅是关于估测斜率（溢漏百分比）。底线是因为补偿率是根据溢漏通道和当前通道的MFI的比值不同来计算的。所以，只要阳性对照（阳性群）的荧光强度足够大，阴性对照（阴性群）的小的绝对误差是可以忽略不计的。补偿率的误差来自于阴性对照和阳性对照MFI的绝对误差之和，而后者的固有误差远大于前者。

2.阳性和阴性的背景荧光强度应该一致。

任何如细胞或者补偿颗粒颗粒之类的能够结合荧光染料的载体都能被用作补偿的单染对照。但是，同一荧光染料的阳性或者阴性载体的自发荧光水平必须一致。这是因为补偿是一种减法运算。因为在补偿运算中不能包括自发荧光，所以如果阳性对照和阴性对照有相同的自发荧光，那么自发荧光对于补偿溢漏计算的影响就可视为零。如果满足这个条件，我们就能将补偿矩阵应用到任何群体。例如，我们可以通过补偿颗粒上的荧光染料计算补偿矩阵，并将其应用到细胞群上。

3. 补偿所用对照的荧光染料必需与当前实验所用的荧光染料一致。

每种荧光染料都有特异的发射波长，因此溢漏是不一致的，即使是发射波长几乎一致的荧光染料（如FITC和Alexa Fluor 488）。当应用于串联染料时，这条规则会变得更为苛刻。每个批次的串联染料（如PE-TR,PE-Cy5, PerCP-Cy5.5, APC-Cy7, etc.）都应被视为是特异的，且应该有其单染对照。如果我们使用了两个不同批次的PE-Cy7在同一实验中，那么需要为其分别做单染对照。不同批次的荧光染料具有不同的结合率，例如，很多Cy7与PE的结合而与其它荧光染料有较少结合。

结束语：

最后，补偿对照的样本与实验样品所用的样本必须经过同样的实验处理。这是因为暴露在光下或者进行固化处理都会改变荧光染料特别是串联染料的结合率。例如，在PE分子上丢失一些Cy7分子。

对于应该使用补偿颗粒还是使用细胞做单染对照的疑惑

在准确度上这两种途径对于补偿是没有区别的。然而，补偿颗粒确实较使用细胞做单染对照有诸多优势。最重要的一点是，珍贵的样品不必浪费在单染对照上。所有细胞都可用来作为实验样品。除此之外，补偿颗粒会特异地针对给定参数提供最强的信号，所以补偿颗粒也理所当然更为精确。细胞在背景荧光中有较大的变化（高变异系数），这意味着溢漏计算有显著的误差，当细胞上的溢漏荧光由自发荧光测算时。而补偿颗粒在背景荧光分布上有更小的误差，意味着溢漏计算会更精确。

当然，补偿颗粒也有一些局限。

1.补偿颗粒不能被用在如PI, DAPI, 或者EMA上，但他们可被用在胺活性可变染料（amine-reactiveviability dyes）上。当然，一些厂家现在已经提供特殊的可用在补偿颗粒上的单染对照染料。

2.补偿颗粒不能结合到所有抗体上，而且在有些情况下他们的荧光强度不够强。

3.对于某些使用串联染料的实验条件，如破膜及固定，必须确定发射光谱不会因串联染料结合到补偿颗粒而变得与其结合到细胞上不同。

实际上在许多实验里，实验者可以一起使用细胞和补偿颗粒, 在某个荧光通道使用细胞样品，在另外一个荧光通道使用补偿颗粒都是可以的。

来源：http://flowjo.typepad.com/the_daily_dongle/page/6/