盛春 吴彬 王爱敏 胡国华

                                     ( 华东理工大学食品科学与工程系 )  

                                             杨柳  李俊辉  周臣飞

                               (福建浦城绿康生化有限公司) 

目前，纳他霉素的测定方法主要有生物效价法、微孔板生物检测法、紫外分光光度计法、元素分析法、比色分析法、薄层色谱法和液相色谱法等。生物效价测定法对实验环境因素（温度等）、材料因素（培养基等）、操作技术等条件要求高，操作过程也比较繁琐；微孔板生物检测法适用大批量的发酵液或样品的检测；紫外分光光度法一般用来做纳他霉素检测的常规对照，若将其用于定量分析，对实验条件要求比较高；元素分析法、比色分析法和薄层色谱法主要用于纳他霉素的定性分析；高效液相色谱法(HPLC)多集中于高纯度纳他霉素产品及食品中纳他霉素残留量的检测分析，是一种行之有效的检测手段。纳他霉素微溶于水、甲醇，溶于冰醋酸及二甲苯甲酰胺，难溶于大部分有机溶剂。室温下在水中的溶解度为30-50mg／L，这种低水溶性不利于它的生物利用度。因此，纳他霉素在食品中应用的最终作用是由使用的浓度和其所在环境下的稳定性共同决定的。本文参照国家药典和食品中纳他霉素的检测方法等国家标准，用高效液相色谱法对纳他霉素在三种食品，酸奶、橙汁、沙拉酱中的分散及残留量变化进行了研究,本研究结论可供实际取样及检测工作提供参考。

1.1主要实验材料

纳他霉素(乳糖、葡萄糖、氯化钠载体型)：由福建浦城绿康生化有限公司提供；

甲醇：色谱纯；

0.22nm微孔过滤器等。

1.2主要仪器和设备

高效液相色谱仪  日本岛津公司

超声波清洗机    昆山市超声仪器有限公司

均质机、电子天平、搅拌器等

1.3实验方法

1.3.1纳他霉素在三种食品中的应用

酸奶制作工艺：原料奶→配料→高温杀菌→冷却接种→分装(添加一定量纳他霉素) →培养(43℃± 2℃培养至凝固)→冷却→后酵(6℃，12h)→产品。

橙汁制作工艺：原料鲜橙→洗涤→破碎、压榨→粗滤→浓缩→均质→调配→分装(添加一定量纳他霉素)→产品。

沙拉酱制作工艺：黄原胶、糖、变性淀粉→混合→溶解→加油和鸡蛋→搅匀→过胶体磨→调配(添加一定量纳他霉素)→搅匀→过胶体磨(3次)→分装→产品。

1.3.2色谱分析条件

流动相：

A相：移取3.0g乙酸铵，1.0g氯化铵到1000ml的烧杯中，加入760ml蒸馏水完全溶解；B相：取四氢呋喃1.25ml与乙睛 60ml充分混合均匀；流动相：A:B=70:30

色谱条件：

柱子：Hypersil ODS2  C18  5um  4.6mm×250mm；波长：303mm；柱温：室温；进样：20ul；流速：1.0ml/min

1.3.3标准溶液的配置

准确称取适量的纳他霉素标准品（精确至0.0001 g），用甲醇溶解，配成浓度为100ug/ml的标准储备液。

1.3.4标准曲线的绘制

用甲醇将配好的纳他霉素标准溶液稀释成质量浓度分别为2.50、5.00和10.0mg／L的标准溶液。按照1.3.2中的条件进样分析。每份标准溶液平行测定5次。以峰面积为纵坐标，纳他霉素浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。

1.3.5样品制备及纳他霉素含量计算

酸奶、沙拉酱样品制备：准确称取10.00g样品，加入30mL甲醇溶液，超声波处理30min，加水10mL，摇匀后放入冰箱中冷冻1小时，取出冷冻后的样品立即过滤，待滤液冷却至室温后，过0.22um针头式过滤器，收集滤液约2mL上机测定。酸奶、沙拉酱中纳他霉素含量计算公式^[11]如下：

X 样品中纳他霉素的含量，单位为微克每克(ug/g)

C 由标准曲线得到样品溶液中纳他霉素的含量，单位为微克每毫升(ug/mL)

V 样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)

M 样品质量，单位为克（g）

橙汁样品测定：准确量取橙汁样品10.0mL，加入30mL甲醇溶液，超声波处理30min，提取液过0.22um针头式过滤器，收集滤液约2mL上机测定。橙汁中纳他霉素含量计算公式如下：

X 样品中纳他霉素的含量，单位为微克每毫升(ug/mL)

C 由标准曲线得到样品溶液中纳他霉素的含量，单位为微克每毫升(ug/mL)

V1 样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)

V2 样品量取体积，单位为毫升（mL）

2 结果与讨论

2.1样品上层纳他霉素含量随时间的变化情况

由表1我们可以看出，分别加入一定量纳他霉素的酸奶、橙汁和沙拉酱在0天（即食品制作的当天）的检测结果分别为：10.24 ppm、10.23 ppm、29.43ppm，由以上实验结果可以得出纳他霉素在刚加入到食品当中时，防腐剂的量和计算加入的纳他霉素的量一致。

图1和图2是三种食品放置7天后食品表层中纳他霉素检测的液相色谱图，分析结果见表1，放置7天后，酸奶表层纳他霉素含量由放置0天的10.24ppm降低到9.91ppm，橙汁表层纳他霉素含量由放置0天的10.23ppm降低到10.21ppm，沙拉酱表层纳他霉素含量由放置0天的29.43ppm降低到23.76ppm，从以上数据可以看出三种食品在放置7天后食品上层中纳他霉素的含量都有所降低。放置15天后，可以看出三种食品在放置15天后食品表层纳他霉素的含量还在继续降低，并且存在下降速率加大的趋势。

图3和图4是三种食品放置30天后食品表层中纳他霉素检测的液相色谱图，分析结果见表1，放置30天后，三种食品在放置30天后食品的表层纳他霉素的含量也较大幅度降低，降低速率更加明显。

我们可以看到，随着时间的变化，纳他霉素在食品上层的浓度在逐渐降低，酸奶放置30天表层纳他霉素含量就由原来的10ppm降到1ppm左右，含量仅为原来的三分之一左右。橙汁酸奶放置30天表层纳他霉素含量就由原来的10降到2.7左右，含量为原来的五分之一左右。沙拉酱放置30天表层纳他霉素含量就由原来的29降到9左右，含量约为原来的三分之一。以上数据说明纳他霉素在食品中有分层或沉降的现象，并且在沙拉酱中沉降速率小于橙汁，在橙汁中的沉降速率小于酸奶，在酸奶中的沉降速率最大，这与纳他霉素溶解性等物化性质有关，在实际纳他霉素检测工作中，取样尤其是表层或上层取样时就要特别考虑到这种

2.2样品中纳他霉素残留量随时间的整体变化情况

图5和图6是三种食品放置7天后，在样品制备之前，先将样品摇匀或搅拌均匀后测得的三种样品中纳他霉素的液相色谱图。从表2的计算结果可以看出，7天后，酸奶中的纳他霉素含量由原来的10.24ppm变为10.16ppm，减少了0.08ppm，橙汁由原来的10.23ppm变为9.92ppm，减少了0.31ppm，沙拉酱由原来的29.43ppm变为29.20ppm，减少了0.23ppm。可以得出：7天后三种食品中的纳他霉素含量都有所降低。15天后，酸奶中的纳他霉素含量由原来的10.24ppm变为9.42ppm，减少了0.82ppm，橙汁由原来的10.23ppm变为9.23ppm，减少了0.99ppm，沙拉酱由原来的29.43ppm变为23.40 ppm，减少了6.03ppm。可以看出，15天后，三种食品中纳他霉素的含量还在降低，并且沙拉酱降低得最快。

由图和表的数据我们可以得出，随着时间的变化，纳他霉素在食品中残留量在逐渐降低，以上数据说明纳他霉素在食品中存在降解现象，并且在沙拉酱在沙拉酱中的降解速率最快。这与姚朔影等^[12]在纳他霉素在奶酪中的降解得出的结论相似。纳他霉素在不同pH下，特别是在酸性条件下，存在不同程度的裂解，产物主要为海藻糖胺，酸奶，橙汁，沙拉酱中都含有酸性物质，导致食品中的纳他霉素存在不同程度的降解，所以随着食品放置时间的延长，食品中纳他霉素的残留量随着降低。三种食品中沙拉酱的pH值最低，所以纳他霉素在沙拉酱中的降低速度最快，放置30天后的纳他霉素的残留量最低。

3.结论

利用液相色谱法对纳他霉素在酸奶、橙汁、沙拉酱中的稳定性和残留量进行了研究，得出以下结论：随着三种食品放置时间的延长，纳他霉素在溶液中呈现分布不均匀，缓慢下降的现象。纳他霉素不溶于水，在水中很难达到均一稳定的状态，所以会导致纳他霉素在食品中分布不均匀、缓慢下降;随着放置时间的延长，同时纳他霉素在三种食品中还存在不同程度的降解情况，引起纳他霉素降解的原因有很多，例如：光、热、pH值等。由于以上三种食品中都存在不同量的酸性物质，所以pH值可能是导致纳他霉素在三种食品中降解的重要原因之一。本研究结论可供实际取样及检测工作提供参考

                                                           ——摘自《中国食品添加剂》,2010.3,有删节

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