六、论述

1．试述柱层析的基本操作过程。

答：1、装柱：①干法装柱

             ②湿法装柱

             注意：湿法装柱中柱内预留一部分水，防止气泡的产生，装柱过程要连贯。平衡。

2、加样：①干法加样

             ②湿法加样

             注意：加样过程中，要防止产生飞溅，量要适中。

3、洗脱：以设定好的流速加入洗脱剂，可以是单一溶剂，也可以梯度洗脱。

         注意：不使柱表面的溶液流干，柱上端保留一层溶液。

4、收集：每隔10mL收集一试管，使用层析的手段或紫外检测器进行实时的检测，合并具有相同物质的流份。

2．木瓜蛋白酶是一种来源广泛的植物蛋白酶，它对蛋白质、短肽化合物、氨基酸酯以及酰胺等多类化合物的水解反应都具有良好的催化活性。被广泛应用于肉类嫩化、啤酒澄清、明胶制造、蚕茧脱胶、皮革脱毛等工业 ,在医疗卫生方面用途前景更为广阔。木瓜蛋白酶的生产以番木瓜未成熟果实的新鲜乳汁为原料 ,如何改进生产工艺、提高产品质量已成为当前急需解决的课题。请就木瓜蛋白酶粗品以及木瓜蛋白酶精制品的生产工艺路线进行分析探讨。

答：自由发挥，只要陈述有理有据即可得分，得分值依内容的正确性和完整性评判。

3．我国是啤酒生产大国,每年有大量的下脚料－啤酒废酵母泥排放，而啤酒酵母中含有丰富的营养物质，拟将其变废为宝，近年来工业上结合使用各项物理、化学或生物技术，将其破壁并降解成富含氨基酸和核苷酸的酵母抽提物，广泛使用于食品与医药行业，既减少环境污染又提高了啤酒工业效益。请根据所学知识，提出一套经济的且技术可行的工业制备方案。

答：自由发挥，只要陈述有理有据即可得分，得分值依内容的正确性和完整性评判。

4.简述pH对发酵液过滤特性的影响，并举例说明。

答：（1） pH直接影响发酵液中某些物质的电离程度和电荷性质，因此适当调节pH值可以改善发酵液的过滤特性。（2）氨基酸和蛋白质在酸性条件下带正电，碱性条件下带负电，等电点时净电荷为零，两性物质在等电点下的溶解度最小，等电点沉淀法在生物工业分离中广泛使用。（3）如味精生产，利用等电点沉淀法提取谷氨酸，一般蛋白质也在酸性范围达到等电点；膜分离中可通过调整pH值改变易吸附分子的电荷性质，减少膜堵塞和膜污染；此外，细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在特定pH下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤进行。

5.以胞内酶提取为例，简要说明双水相系统工业化萃取的主要流程及操作注意点。

答：（1）主要流程：使用PEG/盐系统提取胞内酶时，可先使细胞碎片分配到下相，使蛋白质分配在上相；分离后，上相中的蛋白质可以加入适当的盐，进行二次双水相萃取，目的是利用盐相（下相）去除核酸和多糖；上相中的蛋白质进行第三次萃取，通过pH调节，使上相含色素，蛋白质分配在盐相，以便通过超滤将其和主体PEG分离，主体PEG可循环使用。

（2）操作注意点：实验放大的主要依据是分配系数，遇到的主要问题是细胞碎片相的粘度问题、萃取平衡时间以及相分离问题。需要带低速搅拌和溢流装置的混合－沉降系统；上下相分离利用重力沉降能耗成本低，但高粘度体系要选用离心分离；改变条件再次萃取并结合超滤、透析等处理可实现多聚物的彻底分离。

6.详细叙述利用混合柱生产无盐水的原理及操作方法？

答：采用强酸性阳离子交换树脂除去水中阳离子，平衡离子为氢离子；采用碱性阴离子交换树脂除去水中阴离子，平衡离子为氢氧根。

    （1）水经过混合柱，离子交换后变为无盐水。

（2）逆向通入水，分开阴阳树脂。

（3）分别使用酸碱再生树脂。

（4）逆向通入空气混合树脂。

7. 生物药物在生产制备中的特殊性有哪些?主要有哪些制造方法?

生物药物是以生物材料为原料制取的。其制造技术具有下列特点。

    ①目的物存在于组成非常复杂的生物材料中。②有些目的物在生物材料中含量极微，因

此分离纯化步骤多，难以获得高收率。③生物活性成分离开生物体后，易变性破坏，分离过

程必须十分小心，以保护有效物质的生物活性。④生物药物制造工艺几乎都在溶液中进行，

各种理化因素和生物学因素(如温度、pH、离子强度)对溶液中各种组分的综合影响常常难

以确定，以致许多工艺设计理论性不强，实验结果常带有很大经验成分。⑤为了保护目的物

的活性及结构完整性，生物制药工艺多采用温和的“多阶式”方法，即“逐级分离”法。因

此工艺流程长，操作繁琐。⑥生物药物的均一性检测与化学上的纯度概念不完全相同。由于

生物药品对环境变化十分敏感，结构与功能关系多变复杂，因此对其均一性的评估常常是有

条件的，或者只能通过不同角度测定，最后才能给出相对“均一性”结论。

    生物药物分离制备方法的主要依据原理有两方面。①根据不同组分分配率的差别进行分

离。②根据生物大分子的特性采用多种分离手段交互进行，分离纯化的主要方法有：a．根据分子形状和分子大小不同的分离方法；b．根据分子电离性质(带电性)不同的分离方法；c．

根据分子极性大小与溶解度不同的分离方法；d．根据配基特异性不同的亲和色谱分离法。

    精制一个具体生物药物，常常需要根据它的多种理化性质和生物学特性，采用多种分离

方法有机结合，才能达到预期目的。

8. 孔膜过滤技术的应用？

微孔滤膜孔径在0.025 -14µm范围内操作压力在1---10磅／英寸2之间。

孔径为0.01-0.05µm的膜可以截留噬菌体、较大病毒或大的胶体颗粒，可用于病毒分离。

孔径为0.1µm的膜用于试剂的超净、分离沉淀和胶体悬液，也有作生物膜模拟之用。

孔径为0.2µm的膜用于高纯水的制备、制剂除菌、细菌计数、空气病毒定量测定等。

孔径为0.45µm的微孔滤膜用得最多，常用来进行水的超净化处理、汽油超净、电子工业超净、注射液的无菌检查、饮用水的细菌检查、放射免疫测定、光测介质溶液的净化以及锅炉水中Fe（OH）3的分析等。

9. 简述辅酶Q10制备的工艺路线？

                                       汽油

                                               

猪心肌渣       皂化      速冷      皂化物      萃取    水洗          

减压浓缩       过滤        层析       减压浓缩       结晶     

辅酶Q10结晶

10. 一般生化药物结晶的条件？

1）纯度 ：纯度应不低于50% ，有时虽然纯度不高，若能创造条件，如加入有机溶剂和制成盐等，也能得到结晶。

 2）浓度；一般要求结晶液的浓度较高 ，以利于溶液中溶质分子间的相互碰撞聚合。

3）pH值：一般选择在生化药物pI附近处，有利于晶体析出。如溶菌酶的5%溶 液，pH9.5～10，在4℃放置过夜便析出结晶？

4）温度：通常在低温条件下进行，低温不仅溶解度低，而且不易变性，又可避免细 菌繁殖。在中性盐溶液中结晶时，温度可在o℃至室温的范围内选择。在有机溶剂中一般要求低温，但温度过低时，有时由于粘度大会使结晶些成变慢，可在低温时析出结晶后适当升温。通过降温促使结晶时，如降温快，则结晶粒小，降温慢则颗粒大。生化制药愿要结晶颗粒小的，不包含杂质，减少给粉碎带来的麻烦。

 5）时间：结晶的形成和生长常需要时间，要放置，如果在适合的条件下，在几个小时或几分钟内便可析出结晶。生化制药上要求在几小时之内能完成，时间不宜过长。

 6）晶种：不易结晶的生化药物常加晶种 。

11. 影响离子交换树脂交换速度的因素？

    ①树脂颗粒的大小：树脂颗粒大小要适中。

    ②搅拌和流速。

    ③离子浓度：过稀、过浓都对交换速度不利。

    ④离子的水化半径：离子在水溶液中要发生水化，水化离子在水溶液中的大小以水化 半径来表示。水化半径小的离子，较易吸附。

    一价阳离子；Li+<Na+<k+≈NH+<Rb+<Cs+<Ag+<Ti+

    二价阳离子：Mg2+<Cu2+≈Ni2+<Co2+<Ca2+<Sr2+<pb2+<Ba2+

   阴离子：F—<HCO3—<C-<HSO3—<Br—<NO3—<I—<Cl3—

   ⑤树脂酸碱性的强弱和溶液的pH值。

   ⑥交联度愈低，树脂愈易膨胀，交换速度也就愈快。

   ⑦有机溶剂的影响：当有机溶剂存在时，会降低树脂对有机离子的选择性，而容易吸附无机离子。

12. 简述制备胱氨酸的工艺路线？

      [水解]                      [中和]

      10N盐酸                  30%NaOH

① 猪毛                    水解液               胱氨酸粗品（Ⅰ）（2分）

  117℃，6.5—7小时           PH4.8

     [粗制]

②2N盐酸，8%活性炭         30%NaOH                        

滤液                   胱氨酸粗品（Ⅱ） （2分）

85℃，0.5小时            PH4.8

     [粗制]

③1N盐酸，3—5%活性炭         12%氨水

                          滤液              胱氨酸             （1分）

85℃，0.5小时              PH3.5—4.0