六、结肠
    结直肠癌、结肠息肉病等组织的基因改变，一直受到学者们的关注，然而，基因芯片技术的诞生第一次使得同时观察整体基因表达语的改变成为可能。
（一）结直肠癌发病机理的研究
    Lin等采用基因芯片技术进行的研究显示作为β-链蛋白/T细胞因子调节通路下游的AFl7基因[急性白血病中t(11；17)(q23；q21)与MLL基因融合的片段，根据β-链蛋白积累情况改变活性]产物可能与β-链蛋白-T细胞因子-T-细胞因子/淋巴增生因子信号途径和发挥促生长的作用的致癌蛋白有关。这些发现将通过阐明结肠癌和急性白血病发病机制，为诊断、治疗和预防新策略的发展提供有价值的资料。
    为了明确结肠癌进展和获得转移能力过程中基因表达改变的规律，Otsuka等用包含2 280项基因的自制cDNA芯片发现与原发结肠癌灶组织相比，转移性结肠癌组织中有6项基因(肿瘤相关抗原L6、L-基质素、人类同源酵母核糖体蛋白S28、B-细胞移位基因、线粒体天冬酸氨基转移酶和HLA-A)表达上调，2项基因(角蛋白5和磷酸葡糖变位酶)表达下调。这些结果与组织中蛋白分析结果一致。研究结果提示，L-基质素的表达与结肠癌进展等级相一致。L-基质素可能是结肠癌转移的分子标志之一。
    在包括结肠和肝脏的多种肿瘤中有APC和CTNNBl(β-链蛋白)的改变。这些基因的突变可导致细胞内β-链蛋白的累积，激活WNT信号传递途径的组分，可能与结直肠癌的发生有关。Takahashi等采用cDNA芯片分析了包括β-链蛋白/TCF途径中的基因，向SW480细胞株转染APC从而细胞内消除β-链蛋白后,包括黏膜型基质金属蛋白酶(MTl-MMP)的84项基因表达下调。而在24株结肠癌细胞的22株中MTl-MMP的表达上调。因此，作者推测β-链蛋白的积累是通过影响MTl-MMP的表达而发挥对结肠黏膜的致癌作用的。
    Nambiar等在某些结肠癌细胞中用基因芯片分析基因表达谱时发现p53的表达有不同的改变(表达上调、下调和正常)，虽然在有些肿瘤组织中p53的表达水平上调30倍，但似乎并没有发挥生物学效应，也末见其诱导p27基因表达的变化。在用azoxymethane(AOM)诱导的鼠结肠肿瘤激光微切获得的肿瘤组织中，p53基因的外显子5～7在多重肿瘤细胞中是正常的。提示在交互阅读框(ARF)-p53途径中高水平的ARF足以稳定p53，使其不发挥生物效应，致癌基因的作用机制可能在ARF-p53通路以上。在结肠癌发病机制研究方面，Suzuki等采用cDNA芯片筛查了经甲基化和抑制组蛋白乙酰化后的结肠癌细胞株基因表达水平的变化，结果发现基因启动子去甲基化和抑制组蛋白乙酰化后的基因表达上调；高甲基化的基因家族表达下调。不但证实抑癌基因启动子甲基化和组蛋白乙酰化是导致结肠癌发生的重要机制之一。
    结肠霸膜细胞从向肠腔表面移行的过程中经受细胞周期的调节、种系特异性分化和调亡的过程。体外培养发现模型也存在许多这类变化。Mariadason等采用cDNA芯片分析了这种细胞模型中与结肠黏膜细胞分化有关的特征。该项研究发现Caco-2结肠癌细胞株在这一细胞分化进程中有多项功能基因在表达水平上的相应改变。细胞分化过程中的多数基因(70%)在癌细胞中是表达下调的。Caco-2分化障碍与细胞周期进程和DNA合成有关的基因表达下调相一致。同时，与RNA剪接和运输、折叠和渐变相关的基因以及继后的蛋白表达也相应下调表达。相反，对抗细胞分化和化疗药物代谢的有关基因却有表达上调。上调表达的基因包括细胞外基质沉积蛋白、脂质转运和代谢等相关基因。与上述细胞生物学特性有关的信号传递同路的成分和许多转录因子也发生相应的变化。
    β黏蛋白和盘状球蛋白（γ-球蛋白）是与钙黏蛋白结合参与细胞黏附的同类蛋白β黏蛋白也是WNT信号传递通路中的关键因子，是LEF/TCF转录因子的共同激活因子。为了寻找β黏蛋白和盘状球蛋白新的靶基因，Conacci-Sorrell等用DNA微矩阵杂交技术分析细胞内RNA的转录量。结果证实Nr-CAM是两种黏蛋白调节的关键基因。无论是β黏蛋白还是盘状球蛋白的过度表达在多种细胞中诱导Nr-CAM，而且LEF/TCF启动子结合端要求黏蛋白而激活。经反转录病毒将Nr-CAM转入NIH3T3细胞刺激细胞的生长，增强细胞的运动，诱使细胞转化，以及是在裸鼠中迅速导致肿瘤的生长。Nr-CAM和LEF-1在人结肠癌组织和人黑色素瘤细胞株中有过高表达，但在黑色素细胞和正常人结肠组织中的表达正常。LEF-1阴性降低Nr-CAM的表达，抗Nr-CAM抗体可抑制B16黑色素细胞的运动。结果提示β黏蛋白和盘状球蛋白诱导的Nr-CAM转录导致黑色素瘤和结肠癌细胞增生和运动能力增强，可能是癌变机制之一。
    CDNA基因芯片技术用于确定药物治疗反应在肿瘤细胞基因表达谱特征的联系。Zhou等采用含有1 694项癌相关基因的cDNA芯片观察结肠癌细胞HCTll6的基因表达谱对拓扑酶Ⅰ抑制剂喜树碱(CPT)的治疗反应。CPT治疗前首先在细胞S期应用阿非迪霉素〔APH〕，再用20和1 000 nMCPT进行哺育，可逆和不可逆地阻断G2期，应用cDNA芯片分析其基因表达谱。33项基因在前20 h的表达水平改变可分成3组。几个P53激活基因在1 000 nMCPT治疗后或持续暴露于APH时表达上调。但是，这些基因的上调并没有阻断细胞周期的进展。相反，细胞周期依赖性有丝分裂相关基因的上调在治疗后出现延迟或阻断。这组基因的表达抑制至结与细胞G2期停顿有关。另外，在肿瘤细胞中下调的基因，在细胞周期停顿后恢复表达。基因芯片试验结果提示，细胞G2期延迟中野生型DNA损伤的分子学机制与G2期永久阻断的分子学机制有本质的区别。
（二）结肠癌的分子诊断方面
    通过基因芯片技术对结直肠癌基因表达谱的筛选可以发现若干与癌发生发展有关的基因表达变化，将这些特异性表达变化的基因序列重新排列用于结直肠癌的诊断，理论上是可行的。Takemasa等进行了这类有益的尝试。为了获得结直肠癌的基因草图，构建人结直肠特异性cDNA芯片[他们称之为“结肠芯片”(Colonochip)]，研究者应用cDNA基因芯片技术筛选了结肠癌、正常结肠黏膜和结肠癌转移灶的基因表达情况。芯片包括来自3种类型人cDNA文库30 000条基因中的4 608条独立表达的基因序列，也包括了文献报道怀疑与结直肠癌有关的170条基因。应用这种结肠芯片，发现59条与正常组织相比在癌组织中表达水平上调2倍和2倍以上的基因。
Stremmel等认为DNA芯片杂交技术以及聚类分析的研究方法是从成千上万项基因中筛选出对结肠癌分子诊断有意义的基因标志物的良好方法。他们在6 000以上的基因中经上述方法找出100～500项可能有意义的基因，这些基因列表对进一步的研究划定了一个可能的范围。Lin等用同样的方法从23 040项基因中确定了50项可能区分结肠腺瘤和结肠癌的表达差异基因项。显示出基因芯片技术的高效性。
（三）结直肠癌的预防和治疗
    基因芯片技术对结直肠癌基因的研究，还有利于揭示某些基因的功能，发现某种治疗基因耙标，以及利用基因表达情况的变化观察药物和基因治疗的疗效。Soeth等在tet-off启动子系统控制下从完整结肠癌细胞抽提以CEA为耙标的核酶。这种方法可以调控50％的CEA mRNA和蛋白水平，并用cDNA基因芯片检测CEA介导的细胞基因表达谱的改变。通过273条基因的筛查发现，CEA改变不同癌相关基因组、特别是细胞周期和凋亡基因。尽管细胞周期基因表达水平的改变是双向的调节异常，但是细胞凋亡基因被CEA间接下调。在平行表型研究中，CEA不影响细胞周期和增生比例。然而，CEA显著保护HT29细胞在多种环境中(包括融合性生长、紫外线、IFN-gamma处理和5-氟尿嘧啶处理)不遭受凋亡。研究提示CEA影响结肠癌细胞的凋亡，是结肠癌细胞的永生性因子。结肠癌细胞中过氧化物酶体增生物激活受体的耙基因(PPARgamma)抑制结肠癌细胞的生长，并且刺激上皮来源肿瘤细胞的分化。Gupta等采用基因芯片技术确定PPARganma的基因耙标。同时应用PPARganma激动剂和拮抗剂，发现PPARganma导另外3个癌胚抗原家族。
    Stierum等提出基因芯片技术对结肠组织和结肠癌细胞基因表达变化的分析有望了解抗结肠食物成分的发现和机理研究。流行病学和临床前研究表明ω-3脂肪酸(omega-3 fatty acids,n-3 PUFAs)可以减少结肠癌的发病危险。二十二碳六烯酸(DHA)是含有n-3 PUFAs的主要成分。许多研究表明食物中的n-3 PUFAs部分地通过调节信号传递系统改变与结肠癌细胞生长有关的基因表达影响结肠癌细胞的生长。Narayanan等采用结肠癌细胞CaCo-2，以DNA低聚寡核苦酸芯片分析DHA对人结肠癌基因在转录水平的影响。结果显示DHA抑制CaCo-2细胞的增殖，诱导调亡。采用的基因芯片包含156个功能分类的3 800项基因。下调表达的基因中包括RNA聚合酶Ⅱ中的9个成员、转录辅抑制蛋白和增强结合蛋白如AP2相关基因，以及具有锌指结构组转录因子。激活与诱导调亡程序有关的细胞色素C过程中的多种成分。激活细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子如p21(wafl/cipl)、p27、p57、p19和生长抑制性蛋白相关基因上调表达2倍以上。而且抑制抗凋亡的Bcl-2家族基因的表达，抑制前列腺家族基因、脂加氧酶的表达。DHA改变过氧化物酶体增生物(PPARα和γ)的表达似乎提示，脂质过氧化诱导的调亡是细胞周期调节基因修饰的反映。这些发现提示结肠癌前细胞中可能具有多种癌前基因和转录因子组成的调节途径和机制确定DHA的化学预防炎症和癌中形成的作用。
    5-氟尿嘧啶(5-FU)广泛应用于结肠癌的化疗，但调节其细胞毒性作用的基因尚不被了解。Takahashi等采用包含7 000项基因的高密度寡核苷酸芯片在应用5-FU的结肠癌细胞中进行了筛选。结肠癌细胞SW620中被5-FU显著上调表达的基因是维生素D3上调蛋白1(VDUP1)，但维生素D3的受体相关基因并无表达改变。提示VDUP1表达上调可能与5-FU的细胞毒性作用有关。
    在动物模型中XK469对抗癌细胞增生，Nakeff观察了XK469人结肠腺癌细胞株HCT-116基因表达特征及细胞内蛋白表达的影响。研究采用包含1 152项癌相关基因的独特癌特异性cDNA芯片(GeneMap(TM)癌相关微矩阵)和2维明胶电泳，分析与XK469环境下培养24 h癌细胞株的基因表达情况。结果1 152项癌相关基因中71项的表达水平超过原来的2倍以上或者下调至原来的一半以下。从这些基因的变化可以认定该药物主要影响细胞的MAPK信号传递通路。
    在结肠癌治疗中光敏素介导的光动力疗法(Photofrin-mediated photodynamic therapy，PDT)是近年来的新进展，但有些结肠癌细胞对PD无效，耐受机制尚不清楚。Wang等采用DNA芯片技术分析了耐PDT结肠癌细胞株HT29-P14与其父代细胞HT29基因表达的差异。发现HT29-P14细胞中小热休克蛋白27(Hsp27)的表达显著增多。将Hsp27转染到HT29细胞中，HT29细胞中Hsp27的表达显著增加，细胞即获得PDT后的存活能力。证明Hsp27表达增强是HT29-P14耐PDT的主要机制之一。
    对质膜蛋白早期反应的大鼠单克隆抗体LMR。12在多种化疗药物耐药癌细胞中有着色增强。Sche5er等在研究中观察到在包括黑色素瘤、肾、结肠和肺癌的55株非药物选择细胞株中，有36株肿瘤细胞有明显的的LMR-12着色，但在其他肿瘤如白血病和卵巢癌中很少着色。在多种耐药的纤维肉瘤细胞株HTl080/DR4中分离出编码LMR-12的cDNA。其序列与人类组织相容抗原Ⅰ相同。LMR-12/β2-微球蛋白染色结果由mRNA微矩阵杂交资料所证实。
    已有学者认为NSAIDs药物因对COX—2的抑制作用而有抗结肠癌的作用。日本学者Iizaka等采用cDNA基因芯片分析了非甾体消炎药(NSAIDs)对结肠癌细胞基因表达的影响。研究采用3种细胞，即对NSAIDs敏感的结肠癌细胞株SW480和SW948，以及对NSAIDs抵抗性的SNU-C4细胞。用含有23 040项基因位点的cDNA芯片在3株细胞中共筛选出112项对舒林酸有反应的基因和176项对阿司匹林有反应的基因。另外，分别有130项和140项仅对舒林酸和阿司匹林单独有反应。研究结果有助于理解NSAIDs对结肠上皮增生的抑制作用机制，为确认结肠癌相关的新基因和预防干预的靶标分子提供有价值的线索。
    基因芯片技术还用于观察环境和药物对结直肠上皮或癌组织基因表达的影响。对于药物作用机制研究及新药的开发有所帮助。Frantz等为了探讨大蒜与结肠癌之间的关系，用大蒜提取物处理人类腺癌细胞株HT-29后较多的细胞处于G2/M期(贴壁细胞27％对12％，不贴壁细胞89％)。芯片检测显示表皮生长因子受体和整合素•alpha6等有2倍以上的表达上调。显示大蒜成分的抗癌作用。Mariadason等也以此项技术发现短链脂肪酸诱导SW20结肠上皮细胞包括信号传递和细胞周期过程基因的表达改变。
（四）结直肠教膜炎症方面的研究
    有研究表明维生素A缺乏可能诱导或加重大鼠胃肠道教膜的炎症，Nur等采用cDNA芯片杂交技术分析了维生素A缺乏诱导的结肠炎和2，3，4三硝基苯甲酸(2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)诱导结肠的基因表达情况。采用的芯片包含1 152项来源于Cao-2结肠细胞株的cDNA复制物。两种结肠炎症的基因表达改变相似，差别表达的基因包括翻译起始因子A4、翻译延伸因子1、鸟氨酸脱羧酶(ODC)和角蛋白19的表达明显下调；精脒/精胺Nl-乙酰基转移酶(SSAT)和多泛素(UbC)明显上调。结果提示，维生素A缺乏和化学性大鼠结肠黏膜组织炎症在分子机制上没有明显的差别。
    Kabashima等采用8种类型前列腺素受体和亚型中每一种缺陷的大鼠DSS引导的结肠炎模型研究前列腺素在疾病中的作用。DNA基因芯片杂交分析显示与免疫反应有关的基因表达上调，与黏膜修复和EP4-缺陷大鼠结肠重塑有关的基因下调。提示前列腺素的作用与结肠黏膜修复和结构重建有关。【提供服务：生物芯片整体解决方案、兽药残留芯片检测系统；生物芯片扫描仪等仪器；耳聋基因芯片、乙肝病毒耐药检测芯片、抗核抗体检测蛋白质芯片、结核分枝杆菌耐药检测芯片、G+细菌鉴定与耐药检测基因芯片等；食源性致病微生物检测试剂盒、兽药残留芯片检测试剂盒等；HLA基因分型检测方案、血小板基因分型；人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片服务、家蚕全基因组寡核苷酸微阵列芯片服务、人肿瘤相关基因寡核苷酸微阵列芯片服务、miRNA微阵列芯片服务、DNA甲基化谱检测寡核苷酸芯片服务等；合作共建研究中心服务、生物芯片实验室建设服务、科研课题研究服务；糖尿病超强化治疗技术应用项目合作。请联系索取详细产品和服务介绍资料：医学与生命科学服务中心暨虫洞（北京）卫生科技有限公司，戴天岩  主任、总经理，手机：13051069337，E-mail:davad311@126.com，msn:davad311@hotmail.com,qq:104974415，虫洞医学与生命科学网http://blog.sina.com.cn/cnyr】