加载中…微生物工程实验教案
(2011-12-07 10:09:58)
标签：
教育 |
分类： 实验教案与仪器说明 |
实验一
一、实验器材
1.菌株
从自然界筛选得的蛋白酶产生菌株
2.溶液和试剂
蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，Na2CO3，Folin试剂，硼砂，酪氨酸等。
3.仪器和其他用品
三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，刻度尺，玻璃小漏斗和滤纸等。
二、目的要求
1.学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法。
2.学习并掌握细菌菌株的摇瓶液体发酵技术。
3.掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法。
三、基本原理
自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。但是，由于不同类型的蛋白酶（例如酸性或中性蛋白酶）都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈。细菌在平板上的生长条件也和液体环境中的生长情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。通过初筛得到的菌株还必须用发酵培养基进行培养，通过对发酵液中的蛋白酶活力的仔细调查、比较，才有可能真正得到需要的碱性蛋白酶高产菌株，这个过程被称为复筛。需要指出的是，因为不同菌株的适宜产酶条件差异很大，常需选择多种发酵培养基进行产酶菌株的复筛工作，否则有可能漏掉一些已经得到的高产菌株。例如，本实验推荐的玉米粉黄豆饼粉培养基可用于对芽胞杆菌属细菌的产酶能力进行比较，对于其他属种的细菌未必合适。
碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747（工业用蛋白酶测定方法）进行。其原理是Folin试剂与酚类化合物（Gyr、TrP、Phe）在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋白酶分解酪蛋白（底物）生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计比色测定可知酶活大小。
四、操作步骤
1.培养基和试剂的配制
（1）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶。
脱脂奶粉用水溶解后应单独灭菌（0.06MPa，30min），铺平板前再与加热熔化的肉汤蛋白胨培养基混合。
（2）发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉3%，Na2HPO40.4%，KH2PO40.03%，3mol/LNaOH调节pH到9.0，0.1MPa灭菌20min；250mL三角烧瓶的装瓶量为50mL。
玉米粉、黄豆饼粉不溶于水，培养基配制过程中加热煮沸、pH调节分装到三角烧瓶等环节应注意用玻璃搅拌棒不断搅拌，以保证培养基均匀、一致。
（3）pH11硼砂-NaOH 缓冲液：硼砂19.08g溶于1000mL水中；NaOH4g溶于1000mL水中，二液等量混合。
（4）2%酪蛋白：称取2g干酪素，用少量0.5mol/LNaOH润湿后适量加入pH11的硼砂NaOH缓冲液，加热溶解，定容至100mL，4℃冰箱保存，使用期不超过一周。
用于润湿干酪素的NaOH的量不宜过多，否则会影响配制溶液的pH；加热溶解过程中可使用玻璃搅拌棒不断碾压干酪素颗粒，帮助其溶解。
2.酶活标准曲线的制作
用酪氨酸配制0~100ug/mL的标准溶液，取不同浓度的酪氨酸溶液1mL与5mL0.1mol/Lna2CO3、1mLFolin试剂混合，40℃水浴中显色30min，680nm测定吸收值并绘制标准曲线，求出光密度为1时相当的酪氨酸质量（ug），即K值。
3.用选择平板分离蛋白酶产生菌株
取少量土样混于无菌水中，梯度稀释后涂布到牛奶平板上，37℃培养30h左右观察；用地衣芽胞杆菌作为对照菌株。
家畜饲养、屠宰等动物性蛋白丰富的地点土地壤中筛选获得高产蛋白酶菌株的概率更大。
4.产蛋白酶菌株的观察与转接
对牛奶平板上的总菌数和产蛋白酶的菌数进行记录，选蛋白水解圈最大的10个菌株进行编号，用刻度尺分别测量、记录菌落和透明圈的直径，然后转接到肉汤琼脂斜面上，37℃培养液。
5.用发酵培养基测定蛋白酶产生菌株和作为对照的地衣芽胞杆菌一起接种到发酵培养基中，37℃、200r/min摇床培养48h。（为避免误差，有条件的情况下上述菌株每个应平行接种3瓶发酵培养基）
6.酶活力的测定
将发酵液离心或过滤后按照下列程序测定碱性蛋白酶活力
|
空白对照 |
样品 |
|
发酵液（或其稀释液）1mL |
发酵液（或其稀释液）1mL |
|
0.4mol/L三氯醋酸3mL |
2%酪蛋白1mL |
|
2%酪蛋白1mL |
40℃水浴保温10min |
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0.4mol/L三氯醋酸3mL |
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静置15min，使蛋白质沉淀完全，然后用滤纸过滤，滤液应清亮，无絮状物 |
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滤液1mL |
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0.4mol/L Na2CO3 5mL |
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Folin试剂1mL |
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40℃水浴保温20min，于680nm处测OD值 |
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碱性蛋白酶活力单位U，以每毫升或每克样品在40℃，pH11条件下，每分钟水解酪蛋白所产生的酪氨酸质量（ug）来表示。
U=K×A×N×5/10
式中：K---由标准曲线求出光密度为1时相当当的酪氨酸质量（ug），本实验K=200
N---稀释倍数
A---样品OD值与空白对照OD值之差
5/10---因测定中吸取的滤液是全部滤液的1/5，而酶反应时间为10min。
获得本实验成功的关键
（1）自然界中能够分泌胞外蛋白酶的菌株很多，但真正高产碱性蛋白酶菌株的获得必须依赖于大量艰苦、细致的初筛和复筛工作。
（2）通过初筛分离获得的菌株在进行复筛前应通过平板划线等方法确保菌株的纯度。
（3）通过复筛得到的高产菌株还应该以该发酵培养基为基础，进一步优化培养条件，使菌株的产酶能力进一步提高。
五、实验报告
1.结果
将结果填入表中并对每个菌株的菌落情况进行简单说明：
|
菌株 编号 |
菌落 直径 |
蛋白水 解圈直径 |
蛋白水解圈/菌落直径比值 |
发酵液中的酶活力 |
|||
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1 |
2 |
3 |
平均酶活 |
||||
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1 |
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2 |
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3 |
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4 |
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5 |
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6 |
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7 |
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8 |
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9 |
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10 |
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对照 |
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2.思考题
（1）在选择平板上分离获得蛋白酶产生菌的比例如何？试结合采样地点进行分析。
（2）在选择平板上形成蛋白透明水解圈大小为什么不能作为判断菌株产蛋白酶能力的直接证据？试结合你初筛和复筛的结果进行分析。
准备工作：每组包2包每包6套培养皿，包1ml吸管10支，7支装有9ml水试管，玻璃珠三角瓶装45ml水（下次加5g土样），配置培养基等。
实验二
一、实验器材
1．菌株
上一个实验筛选获得的蛋白酶产生菌株，地衣芽胞杆菌。
2．溶液和试剂
在上一个实验所用溶液和试剂的基础上增加革兰氏染液，芽胞染色液，葡萄糖，（NH4）2SO4，MgSO4·7H2O等。
3．仪器和其他用品
在上一个实验所用仪器和用品的基础上增加：显微镜及相关用品，牙签等。
二、目的要求
1．学习对自然筛选的未知细菌菌株进行初步分类鉴定的方法。
2．学习并掌握微生物诱变育种技术的基本思路和方法。
三、基本原理
很多微生物都有产生胞外碱性蛋白酶的能力，其中用于碱性蛋白酶工业生产的主要菌株及最重要的研究、开发对象大多数来自芽胞杆菌属，地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、短小芽胞杆菌等目前都是重要的蛋白酶生产菌。而除芽胞杆菌外的其他具有碱性蛋白酶生产能力的菌株大多都是革兰氏性细菌，例如假单胞菌、赛氏杆菌等。由于不同属种的细菌的产酶条件不同，因此对从自然界中筛选分离的产酶菌株进行大致分类有助于对分离菌株的产酶能力进行正确的评估和优化。本实验拟通过革兰氏染色、芽胞染色等技术对从自然界中分离筛选的蛋白酶产生菌株进行大致的分类定位。
另一方面，由于自发突变的概率一般仅为10-6-10-9之间，变异程度较轻微，从自然界中直接筛选获得满足生产需要的高产菌株的概率小。要想获得具有实验应用潜力的优良菌株，还必须通过物理或化学手段提高菌株的突变率进行诱变育种。
紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素。它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶间形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。因此，为了避免光复活，用紫外线照射处理以及处理后的操作应在红光下进行，并且将照射处理后的微生物放在暗处培养。
硝基胍（NTG）是一种有效的诱变剂，在低致死率的情况下也有很强的诱变作用，故有超诱变剂之称，它的主要作用是引起DNA链中GC→AT的转换。亚硝基胍也是一种致癌因子，在操作中要特别小心，切勿与皮肤直接接触。凡有亚硝基胍的器皿，都要用1mol/L NaOH溶液浸泡，使残余的亚硝基胍分解破坏，然后清洗。
本实验以紫外线作为单因子诱变剂处理产生蛋白酶的地衣芽胞杆菌，根据试验菌株诱变后在蛋白培养基上透明圈直径的大小来指示诱变效应。一般来说，透明圈越大，酶活性越强。
四、操作步骤
1．培养基和试剂的配制
（1）芽胞染色液、革兰氏染液，牛奶平板等配制方法参见上一实验及相关资料。
（2）淡薄培养基：酵母膏 0.07%；蛋白胨 0.1%；葡萄糖 0.1%；（NH4）2SO4 0.02%；MgSO4·7H2O 0.02%；K2HPO4 0.4%；琼脂 2%，pH7.2-7.4，0.06MPa，30min灭菌。用于菌株产芽胞情况检查。
形成芽胞是芽胞杆菌属细菌的关键特征，但不是所有的芽胞杆菌都能在任何情况下形成芽胞。因此，在鉴定菌株是否为芽胞杆菌时，宜采用生胞子培养基进行培养后再进行芽胞染色检查。本实验采用的淡薄培养基是几种生胞培养基中效果较好的一种。
2．革兰氏染色
将上一个实验筛选的获得的菌株进行革兰氏染色检查，以地衣芽胞杆菌作为对照菌株。
3．芽胞检查
将上述的菌株接种到淡薄培养基平板上，37℃培养2d后进行芽胞染色观察。以地衣芽胞杆菌作为对照。
4．产蛋白本科高产菌株的紫外诱变
（1）菌悬液的制备
①取培养48h生长丰满的地衣芽胞杆菌斜面4-5支，用10mL左右的无菌生理盐水将菌苔洗衣下，倒入一支无菌大试管中。将试管在振荡混合器上振荡30s，以打散菌块。
②将上述菌液离心（3000r/min，10min），弃上清液。用无菌生理盐水将菌体洗涤2-3次，制成菌悬液。
③用显微镜直接计数法，调整细胞浓度为108个/mL。
（2）平板制作
将牛奶平板培养基倒平板27套，凝固后待用。
（3）紫外线处理
①将紫外线灯开关打开，预热20min。
②取直径7cm无菌平皿2套，分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液3mL，并放入一根无菌搅拌棒或大头针。
③上述2套平皿先后置于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离为30cm，功率15W的紫外灯下分别搅拌照射1min和3min。盖上皿盖，关闭紫外灯。
照射计时从开盖起，加盖止。先开磁力搅拌器开关，再打开皿盖照射，使菌悬液中的细胞接受照射均等。
（4）稀释
用10倍稀释法把经过照射的菌悬液在无菌水稀释成10-1-10-6。
（5）涂平板
取10-4、10-5、10-63个稀释度涂平板，每个稀释度3套平板，每套平板加稀释菌液0.1mL，用无菌玻璃涂捧均匀地涂满整个平板表面。以同样的操作，取未经紫外线处理的菌液稀释涂平板作为对照。
从紫外线照射处理开始，直到涂平板的几个操作步聚都要在红灯下进行。
（6）培养
将上述涂匀的平板，用黑色的布或纸包好，置培养2d。注意每个平板背面要事先标明处理时间和稀释度。
（7）计数
将培养好的平板取出进行细菌计数。根据对照平板上CFU数，计算出每毫升菌液中的CFU数。同样计算出紫外线处理1min和3min后的CFU数及致死率。
存活率=----------------------------------- ×100%
对照每毫升CFU数
对照每毫升CFU数 - 处理后每毫升CFU数
存活率=----------------------------------------------------------- ×100%
对照每毫升CFU数
8．观察诱变效应
对平板上菌落的蛋白水解圈情况进行观察，从不同诱变处理的平板上选择5个蛋白水解圈最大的菌株进行编号，用米尺分别测量、记录菌活和透明圈直径，然后转接到肉汤琼脂斜面上，37℃培养过液。
五、实验报告
1．结果
（1）将自然筛选初步鉴定的结果填入表中
|
菌株编号 |
细胞形态 |
革兰氏染色 |
是否判断为芽胞杆菌 |
产酶情况（上一个实验） |
|
|
蛋白水解圈/菌落直径比值 |
酶活力 |
||||
|
1 |
|
|
|
|
|
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2 |
|
|
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3 |
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|
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4 |
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|
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|
5 |
|
|
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|
|
|
6 |
|
|
|
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|
|
7 |
|
|
|
|
|
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8 |
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|
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|
9 |
|
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|
|
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10 |
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|
|
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|
|
对照 |
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|
|
|
（2）将诱变后的初筛、复筛结果填入下表中
|
照射时间 |
产酶情况 |
|||||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
||||||
|
直径比 |
酶活力 |
直径比 |
酶活力 |
直径比 |
酶活力 |
直径比 |
酶活力 |
直径比 |
酶活力 |
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|
1min |
|
|
|
|
|
|
|
|
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|
|
3min |
|
|
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|
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|
|
|
|
2.思考题
准备工作：每组做土壤、诱变液的稀释，10-1--10-6，用10-3--10-6分别用涂布法接到平板上，菌液用10-4--10-6分别用涂布法接到平板上.牛奶100g加水400ml融化后用80度灭菌20分钟加入培养基再道平板。
实验三 灵芝液体发酵培养基优化
一、实验器材
1.菌株
灵芝
2.溶液和试剂
葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、白砂糖、蔗糖、果糖、蛋白胨、、磷酸二氢钾、硫酸镁、蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、硝酸铵等。
3.仪器和其他用品
三角烧瓶，培养摇床，高压灭菌锅，电子分析天平，电热恒温鼓风干燥箱、高速分散器、旋转蒸发仪、量筒等。
二、目的要求
1.了解灵芝对不同碳源和氮源的利用情况
2.学习并掌握灵芝摇瓶液体发酵技术。
3.掌握胞外多糖的提取方法
三、实验原理
灵芝是大型药用真菌。子实体中含较高的蛋白质、脂肪、粗纤维、碳水化合物、真菌类多糖及氨基酸等药用成分，具有清热、消积、化痰、止痛、抗癌等功效。
由于灵芝的野生资源十分有限，而且目前人工栽培较多，但远远满足不了市场的需求，因此，运用发酵工程技术生产灵芝菌丝体，为开发利用这一宝贵资源提供充足的原材料，具有重要的现实意义。本实验应用单因素及正交设计对灵芝液体培养生产菌丝体进行优化，希望为大规模工业化生产树舌菌丝体提供理论基础和技术依据。
四、实验步骤
1．培养基的配制。
加富PDA培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨0. 5%，磷酸二氢钾0.15%,硫酸镁0.05%,琼脂1.8%
摇瓶种子培养基：玉米粉2.0%，葡萄糖2.0%，蛋白胨1.0%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.15%
基础培养基：葡萄糖2%、蛋白胨1%、磷酸二氢钾0. 3%、硫酸镁0.1%
2．培养方法。
种子培养的方法。取已活化的斜面菌丝体，接入三角瓶中，振荡培养6d 得一级种子，如无特殊说明：均在28℃、160r/min 的条件下，培养6d。
发酵培养的方法。按10%接种量接到各发酵培养基中，进行振荡培养。 发酵培养的培养基组成通过试验优化确定。
3．单因素试验设计。
将不同的碳源、氮源代入基础培养基中，研究不同碳、氮源对树舌菌丝产量的影响。碳源优化试验中基础发酵培养基中分别以2%葡萄糖、麦芽糖、2%可溶性淀粉、2%白砂糖、2%蔗糖和2%果糖为碳源。氮源优化试验中基础发酵培养基中分别以1%蛋白胨、1%酵母膏、1%硫酸铵、1%硝酸铵。
4．正交试验。
为了确定最优碳源、氮源和无机盐的浓度，设计了L9(34)正交试验如表１,配成9种培养基，在250mL三角瓶中装入培养液100mL，每种设3个重复，按10%接种, 28℃、160r/min摇床培养，第6d测定菌丝体干重。
正交试验因素与水平表L9（34）
|
处理号 |
A |
B |
C |
D |
|
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
|
2 |
1 |
2 |
2 |
2 |
|
3 |
1 |
3 |
3 |
3 |
|
4 |
2 |
1 |
2 |
3 |
|
5 |
2 |
2 |
3 |
1 |
|
6 |
2 |
3 |
1 |
2 |
|
7 |
3 |
1 |
3 |
2 |
|
8 |
3 |
2 |
1 |
3 |
|
9 |
3 |
3 |
2 |
1 |
5．生物量测定。发酵液用四层纱布过滤后,菌丝体用清水冲洗干净, 置80℃烘箱烘干至恒重, 电子天平称重。
五、实验报告
1.结果
将所得结果填入下列表格中
（1）碳源与氮源对生长的影响
|
碳源 |
氮源 |
||||||
|
葡萄糖 |
麦芽糖 |
可溶淀粉 |
蔗糖 |
蛋白胨 |
酵母膏 |
硫酸铵 |
硝酸铵 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
（2）正交试验结果
|
试验号 |
A |
B |
C |
D |
菌丝干重（g/L） |
|
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
|
|
2 |
1 |
2 |
2 |
2 |
|
|
3 |
1 |
3 |
3 |
3 |
|
|
4 |
2 |
1 |
2 |
3 |
|
|
5 |
2 |
2 |
3 |
1 |
|
|
6 |
2 |
3 |
1 |
2 |
|
|
7 |
3 |
1 |
3 |
2 |
|
|
8 |
3 |
2 |
1 |
3 |
|
|
9 |
3 |
3 |
2 |
1 |
|
|
K1 |
|
|
|
|
|
|
K2 |
|
|
|
|
|
|
K3 |
|
|
|
|
|
|
k1 |
|
|
|
|
|
|
k2 |
|
|
|
|
|
|
k3 |
|
|
|
|
|
|
R |
|
|
|
|
|
2．将上述表中的数据进行分析确定最佳培养基组合。
准备工作：实验结果观察：平板分离得到的酶君，诱变1分钟、3分钟及空白的菌落数，水解圈的大小差异，挑取单菌落发酵（每组一瓶）。
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