实验一 酸乳制品中乳酸菌的分离

一、实验目的

    学会并掌握从酸乳中分离乳酸菌的技术进一步巩固无菌操作技术。

二、实验原理

酸乳中乳酸菌的分离采用溴甲酚绿（BCG）牛乳营养琼脂平板分离法。溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色，在碱性环境中呈蓝色。在分离培养基（pH6.8）中加入溴甲酚绿指示剂后呈蓝绿色，乳酸菌在该培养基中生长并分解乳糖，产生乳酸，使菌落呈黄色，菌落周围的培养基也变为黄色。乳酸可用纸上层析法鉴别。

三、实验器材

1、材料：市售酸奶

2、培养基：

（1） BCG脱脂乳粉培养基：

A(溶液)：脱脂奶粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿（B.C.G）乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。

     B(溶液)：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g，pH6.8，121℃灭菌20min以无菌操作趁热将A B溶液混合均匀后倒平板。

（2）10%脱脂乳粉培养基 ：脱脂乳粉10g，水100mL，121℃灭菌20min。

2、器材：涂布器、培养皿、无菌生理盐水/无菌水

四、操作步骤

1、制备BCG牛乳营养琼脂培养基。

①称取脱脂奶粉10g，溶于50mL水中，加入1.6%溴甲酚绿酒精溶液0.1mL，0.075MPa压力下灭菌20min。

②另取琼脂2g，溶于50mL水中，加酵母膏1g，溶解后调pH值至6.8，0.1MPa压力下灭菌20min。

③趁热将上述两液以无菌操作混合均匀，倒平板4个。

2、梯度稀释：将样品以10倍稀释法稀释至10^-6，取其中10^-5、10^-6 2个稀释度的稀释液各0.1~0.2mL，分别置于上述各营养平板上，用无菌涂布器依次涂布2个皿，置43℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基亦为黄色者初步定为乳酸菌。

3、将典型菌落转至10%脱脂乳发酵管，43℃培养8~24h，若牛乳管凝固，无气泡，呈酸性，镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色呈阳性，则将其连续传代若干次，43℃培养，挑选出在3~4h能凝固的乳管，保存备用。

4、乳酸菌的鉴定及生物量的测定。

五、结果记录

1、记录分离到的乳酸菌菌落的特征

2、绘制所分离的乳酸菌形态图，并记录结果。

六、思考题

1、为什么要用脱脂乳粉？

2、哪些情况能够引起凝乳？

讲解

同学们都知道酸奶具有一定的保健功能，随着技术的进步经过对乳酸菌菌种的筛选和研究生产不同功能的酸奶：比如具有降低胆固醇功能的、降血压的菌种等等。

实验目的：学会并掌握从乳酸中分离乳酸菌的技术，进一步巩固加深无菌操作技术。

    原理：溴甲酚绿（BCG）牛乳营养琼脂平板分离法。溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色，在碱性环境中呈蓝色。在分离培养基（pH6.8）中加入溴甲酚绿指示剂后呈蓝绿色，乳酸菌在该培养基中生长并分解乳糖，产生乳酸，使菌落呈黄色，菌落周围的培养基也变为黄色。

乳酸发酵：以牛奶中的乳糖、蔗糖在厌氧条件下通过乳酸菌发酵成乳酸。

乳酸菌  链球菌属 ：  同型EMP→2乳酸﹢2APT

乳酸杆菌属：  同型EMP→2乳酸﹢2APT

        明串珠菌属：  异型PK→乳酸﹢乙醇﹢CO₂﹢ATP

        双歧杆菌属：  双歧型HK→乳酸﹢1.5乙酸﹢2.5ATP

酸奶的乳酸菌是以稽热链球菌（唾液链球菌稽热亚种）和保加利亚乳杆菌（德氏乳杆菌保加利亚亚种）以1：1混合而成的。

取1ml酸奶放入9ml无菌水试管变成10^-1，再从10^-1的试管取1ml放入第2根9ml无菌水试管变成10^-2，依此类推一直至10^-6。

配制培养基（BCG溴甲酚绿）→倒平板→酸奶稀释至10^-6分别吸取10^-5、10^-6的溶液0.2ml放入平板并涂布平板→43℃、48小时培养→观察结果。

1.1.3  有关溶液

乳酸菌的分离

将酸奶用灭菌生理盐水10倍稀释成9个梯度（10^-1–10^-9），取0.2mL涂布于MRS平板培养基上。球菌在恒温培养箱中42℃培养24h后，革兰氏染色，镜检观察；杆菌在恒温培养箱中37℃培养72h后，革兰氏染色，镜检观察。试验重复4次，以达到菌种提纯。

1.2.2 乳酸菌的鉴定

1.2.2.1 菌落形态及革兰氏染色鉴定

观察MRS平板培养基上的菌落形态，初步判断菌种属性，并挑取具有典型特征的菌落进行革兰氏染色。

1.2.2.2 BCG牛乳培养基培养鉴定

将所分离两种菌（球菌和杆菌）在无菌条件下用接种环划线于BGG牛乳平板培养基上。球菌在恒温培养箱中42℃培养24h后，观察；杆菌在恒温培养箱中37℃培养72h后，观察。

1.2.2.3 吲哚试验

1）试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。

2）接种培养：以无菌操作分别接种少量菌落到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37℃恒温箱中培养24–48h。

3）观察记录：在培养基中加入乙醚1–2 mL,经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5–10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。

配制培养基→倒平板→梯度稀释→涂布平板→培养观察→挑菌落→接牛乳管→培养观察→传代培养→挑选凝乳管→乳酸测定→菌种保存 

实验二 过氧化氢酶试验

一、实验目的

掌握过氧化氢酶试验原理及方法

二、实验原理

过氧化氢酶又叫触酶，能催化过氧化氢分解成水和氧，某些微生物可以生成这种酶，是种属分类的根据之一。测定过氧化氢酶是否存在，可以加3%H₂O₂于斜面培养的试管中，看它是否产生气泡，若该菌产生过氧化氢酶，在2~3min内，就有不少氧气产生，这项测定主要是用于把乳酸菌和许多厌氧菌与其他细菌区分开来，乳酸菌和许多厌氧菌都是过氧化氢酶阴性。

三、实验器材

1、  菌种：培养24小时的乳酸菌、枯草杆菌和其他供试菌种。

2、  培养基：细菌采用营养琼脂，其他菌类采用适合的斜面培养基

3、  试剂：3%H₂O₂

4、  器皿：接种针、酒精灯、培养箱

四、操作步骤

1、将菌种接种于斜面培养基上，30℃培养24小时。

2、滴入3%H₂O₂数滴于斜面菌体上，若有气泡为阳性。

测定采用的培养基不可有血红素或红血球，不然容易产生假阳性反应，在测定乳酸菌时，应使用至少含有1%的葡萄糖培养基，若在无糖或少糖培养基上生长时，可能产生假阳性。

五、结果记录

记录所测菌体过氧化氢酶实验结果。

六、思考题

怎样避免细菌过氧化氢酶试验的假阳性？ 

过氧化氢酶：

过氧化氢酶（catalase）也称触酶，广泛存在于动植物组织和微生物中，是一种高效、安全、无毒的生物催化剂，白色至浅棕色粉末，分子量约为240000，溶于水，几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。该酶是铁卟呤酶，一个分子中含有4个铁原子，其作用基团是血红素；主要用于过氧化氢和过氧化物的消除，通过催化过氧化氢水解生成水和氧气来去除残余过氧化氢。本品则是由牛肝提取精制成的酶制剂。

产品的理化性能与规格：

1、外观：棕色粉末

2、分子量：240KDa

3、酶活：约35000单位/毫克和3500单位/毫克（两种规格）

4、等电点：pH5.4

酶活力定义：在pH为7.0，A₂₄₀下，25℃条件下每分钟水解1μm过氧化氢所需的酶量为1个活力单位。

过氧化氢酶主要用于橡胶成型、塑料及多泡性粘合剂，纺织品的漂白和染色，食品的杀菌和保鲜等。

众所周知,绝大多数酶都是蛋白质,过氧化氢酶即是一种蛋白质酶,蛋白质在高温下会变性,像煮过的鸡蛋一样,蛋白质会变成固体,就是您看到的沉淀了

  

实验三  细菌对生物大分子的分解利用试验（细菌对生物大分子的影响程度）

一、实验目的

了解不同细菌对不同生物大分子的利用情况以及试验原理，并掌握其操作方法，证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同酶系统。比如米曲酶就是酵母与根霉，还有工业发酵等等都是利用微生物存在不同酶系统而制作的工程。

二、实验原理

微生物在生长繁殖过程中需要不断地从外界环境中吸收营养物质，外界环境中的大分子有机物必须经微生物分泌的胞外酶将其分解为小分子有机物才能被吸收进入细胞而利用。不同的微生物分解利用生物大分子的能力不同，只有那些能够产生并分泌胞外酶的微生物才能利用相应的大分子有机物。

1、淀粉水解试验：某些细菌可以产生淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解成麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。表明细菌产生了淀粉酶。

2、油脂水解试验：某些细菌能分泌脂肪酶（胞外酶），将脂肪水解为甘油和脂肪酸，所产生的脂肪酸，可以改变PH值，使PH值降低由淡红变成深红色。可以通过中性红加以指示，指标范围PH6.8（红）-8.0（黄）。当细菌分解培养基中的脂肪产生脂肪酸，在加有中性红的培养基中则会出现红色斑点。说明细菌胞外存在脂肪酶。

3、明胶液化试验：明胶是一种动物蛋白，用其配制的培养基在低于20℃时凝固，高于24℃时自行液化，在细菌产生的蛋白酶（胞外酶）作用下，可水解成为小分子物质，此时虽在低于20℃的条件下，也不再凝固，而由原来的凝固状态变为液体状态。

4、石蕊牛奶试验：石蕊牛奶中主要含有乳糖、酪蛋白和石蕊等。在牛乳中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂，石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性时呈蓝色，还原时则自下而上褪色，细菌对牛乳的作用有以下几种情况：①产酸：细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红。②产碱：细菌分解酪蛋白产生碱性物质，使石蕊变蓝。③胨化：细菌产生蛋白酶，使酪蛋白分解，使牛乳变得较为澄清略透明。④酸凝固：细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红，当酸度很高时，可使牛乳凝固。⑤凝乳酶凝固：有些细菌能产生凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固。此时石蕊常呈蓝色或不变色。⑥还原：细菌生长旺盛，使培养基氧化还原，电位降低，因而石蕊褪色，上述5种情况石蕊均可还原。

5、尿素试验：尿素是大多数哺乳动物消化蛋白质后被分泌在尿中的废物。尿素酶（脲酶）能分解尿素释放出氨，这是一个分辨细菌很有用的诊断实验。尽管许多微生物都可以产生尿素酶，但它们利用尿素的速度比变形杆菌属的细菌要慢，因此尿素酶试验被用来从其他非发酵乳糖的肠道微生物中快速区分这个属的成员。尿素琼脂含有蛋白胨，葡萄糖，尿素和酚红。酚红在pH6.8时为黄色，而在培养过程中，产生尿素酶的细菌将分解尿素产生氨，使培养基的pH升高，在pH升至8.4时，指示剂就转变为深粉红色。

三、实验器材

  1、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌

2、培养基：

（1）淀粉培养基：蛋白胨10g，NaCl 5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000mL，琼脂20g。

（2）油脂培养基：蛋白胨10g，NaCl 5g，牛肉膏5g，香油或花生油10g，1.6%中性红水溶液，蒸馏水1000mL，琼脂20g，pH7.2。

（3）明胶液化培养基：牛肉膏蛋白胨液100mL（牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g），明胶18g，pH7.2~7.4。 （4）石蕊牛奶培养：牛奶粉100g，石蕊0.075g，蒸馏水1000mL，pH6.8。121℃灭菌15min。

（5）尿素琼脂培养基：尿素20g，蛋白胨1g，琼脂20g，NaCl 5g，KH₂PO4 2g，酚红0.012g，蒸馏水1000mL，pH6.8。

3、器皿：试管、三角烧瓶、培养皿、接种环、接种针等

四、操作步骤

1、淀粉水解试验

（1）将固体淀粉培养基熔化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。

（2）在平板皿底背面用记号笔划分成4部分，分别在4部分标上菌名。

（3）将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、产气肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别在平板各自菌名对应的部分划线接种。

（4）将平板倒置37℃培养24小时。

（5）观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板培养基上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板。如菌体周围出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解，称淀粉试验阳性，否则为阴性。透明圈地大小说明该菌水解淀粉的能力大小。

2、油脂水解试验

（1）将固体油脂培养基熔化后冷却至50℃左右，充分振荡，使油脂均匀分布，无菌操作制平板。

（2）在平板皿底背面用记号笔划分成4部分，分别在4部分标上菌名。

（3）用无菌操作将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、产气肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别划十字线接种于平板相对应部分的中心。

（4）将平板倒置37℃培养24小时。

（5）取出平板，观察菌苔颜色。若平板上长菌的地方出现红色斑点，则说明脂肪已被水解，此为阳性反应，否则为阴性反应。

3、明胶液化试验

  （1）取4支明胶培养基试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。

  （2）用接种针分别穿刺接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、产气肠杆菌和金黄色葡萄球菌。

（3）将接种后的试管置20℃中培养2~5d。

（4）观察明胶液化情况。

4、石蕊牛奶试验

  （1）取4支石蕊牛奶培养基试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。

  （2）分别接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、产气肠杆菌和金黄色葡萄球菌。

（3）将接种后的试管置35℃中培养24~48h。

（4）观察培养基颜色变化。石蕊在酸性条件下为粉红色，碱性条件下为紫色，而被还原时为白色。

5、尿素试验

  （1）取4支尿素培养基斜面试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。

  （2）分别接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、产气肠杆菌和金黄色葡萄球菌。

（3）将接种后的试管置35℃中培养24~48h。

（4）观察培养基颜色变化。尿素酶存在时为红色，无尿素酶时为黄色。

五、结果记录

六、思考题

1、你如何解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？

2、不利用碘液，你能否证明淀粉水解的存在？

3、接种后的明胶可以在35℃培养，在培养后你做什么才能证明水解的存在？

4、请解释在石蕊牛奶中的石蕊为什么能起到氧化还原指示剂的作用。 

参考资料：

像氨基酸、脂肪酸等都叫做生物单分子，是与生命有着密切关系的物质，它们是构成大分子的基本物质。生物大分子是构成生命的基础物质，包括蛋白质、核酸、碳氢化合物等。生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。

　　这个定义只是概念性的，与生物大分子对立的是小分子物质（二氧化碳、甲烷等）和无机物质，实际上生物大分子的特点在于其表现出的各种生物活性和在生物新陈代谢中的作用。

　　比如：某些多肽和某些脂类物质的分子量并未达到惊人的地步，但其在生命过程中同样表现出了重要的生理活性。与一般的生物大分子并无二致。

　　生物大分子大多数是由简单的组成结构聚合而成的，蛋白质的组成单位是氨基酸，核酸的组成单位是核苷酸……

　　生物大分子都可以在生物体内由简单的结构合成，也都可以在生物体内经过分解作用被分解为简单结构，一般在合成的过程中消耗能量，分解的过程中释放能量。

　　高相对分子量的生物有机化合物（生物大分子）主要是指蛋白质、核酸以及高相对分子量的碳氢化合物。与低相对分子量的生物有机化合物相比，高相对分子量的有机化合物具有更高级的物质群 。它们是由低相对分子量的有机化合物经过聚合而成的多分子体系。从化学结构而言，蛋白质是由α-L-氨基酸脱水缩合而成的，核酸是由嘌呤和嘧啶碱基，与糖D-核糖或2-脱氧-D-核糖）、磷酸脱水缩合而成，多糖是由单糖脱水缩合而成。由此可知，由低相对分子量的生物有机化合物变为高相对分子量的生物有机化合物的化学反应都是脱水缩合反应。

　　在原始地球条件下，有两条路径可以达到脱水缩合以形成高分子：其一是通过加热，将低相对分子量的构成物质加热使之脱水而聚合；其二是利用存在于原始地球上的脱水剂来缩合。前者常常是在近于无水的火山环境中进行，后者则可以在水的环境中进行。

　　生物大分子是生物体的重要组成成份，不但有生物功能，而且分子量较大，其结构也比较复杂。在生物大分子中除主要的蛋白质与核酸外，另外还有糖、脂类和它们相互结合的产物。如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白等。它们的分子量往往比一般的无机盐类大百倍或千倍以上。蛋白质的分子量在一万至数万左右，核酸的分子量有的竟达上百万。这些生物大分子的复杂结构决定了它们的特殊性质，它们在体内的运动和变化体现着重要的生命功能。如进行新陈代谢供给维持生命需要的能量与物质、传递遗传信息、控制胚胎分化、促进生长发育、产生免疫功能等等。

　　生物大分子是生物体的重要组成成份，不但有生物功能，而且分子量较大，其结构也比较复杂。在生物大分子中除主要的蛋白质与核酸外，另外还有糖、脂类和它们相互结合的产物。如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白等。它们的分子量往往比一般的无机盐类大百倍或千倍以上。蛋白质的分子量在一万至数万左右，核酸的分子量有的竟达上百万。这些生物大分子的复杂结构决定了它们的特殊性质，它们在体内的运动和变化体现着重要的生命功能。如进行新陈代谢供给维持生命需要的能量与物质、传递遗传信息、控制胚胎分化、促进生长发育、产生免疫功能等等。

　　人类对生物大分子的研究经历了近两个世纪的漫长历史。由于生物大分子的结构复杂，又易受温度、酸、碱的影响而变性，给研究工作带来很大的困难。在20世纪末之前，主要研究工作是生物大分子物质的提取、性质、化学组成和初步的结构分析等。

　　19世纪30年代以来，当细胞学说建立的时候，有人已经研究蛋白质了。蛋白质命名始于1836年，当时著名的瑞典化学家柏尔采留斯(J．Berzelius)和正在研究鸡蛋蛋白类化合物的荷兰化学家穆尔德(G．J．Mulder)就提出用“蛋白质”命名这类化合物。并且把它列为生命系统中最重要的物质。到本世纪初，组成蛋白质的20种氨基酸已被发现了12种，1940年陆续发现了其余的氨基酸。19世纪末，有机化学家们就开始探讨蛋白质的结构。德国有机化学家费舍尔(E．Fischer)与别人合作提出了氨基酸之间的肽键相连接而形成蛋白质的论点，1907年费舍尔又合成了一个由15个甘氨酸和3个亮氨酸组成的18个肽的长链。同时英国晶体分析学派中的贝尔纳(J．D．Bernal)和阿斯特伯理(W．T．Astbury)等曾用X射线衍射分析方法分析羊毛、头发等蛋白的结构，证明它们是折叠卷曲纤维状物质。随着研究的逐步深入，科学家们搞清了蛋白质是肌肉、血液、毛发等的主要成份，有多方面的功能。

　　核酸的发现要比蛋白质晚得多。1868年在德国工作的24岁的瑞士化学家米歇尔(F．Miescher)从病人伤口脓细胞中提取出当时称为“核质”的物质。这就是被后来公认的核酸的最早发现。后来科赛尔(A．Kssel)及他的两个学生琼斯(W．Jones)和列文(P．A．Levene)弄清了核酸的基本化学结构，证实核酸是由许多核苷酸组成的大分子。核苷酸是由碱基、核糖和磷酸构成。其中碱基有4种(腺瞟呤、鸟瞟呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)，核糖有2种(即核糖与脱氧核糖)。据此核酸分成两类：核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。他们根据当时比较粗糙的分析认为，4种碱基在核酸中的量相等，从而错误地推导出核酸的基本结构是由4个含不同碱基的核苷酸连接成四核苷酸，以此为基础聚合成核酸，这就是较著名的“四核苷酸假说”。这个假说从20年代后起统治了核酸结构的研究大约20多年的时间，对认识复杂的核酸结构和功能起了相当大的阻碍作用。核酸当时虽然是在细胞核中发现的，但由于它的结构过于简单，也就很难想象它能在异常复杂多变的遗传现象中起什么作用。甚至有些科学家在当时蛋白质的结构被阐明之后，认为很可能是蛋白质在遗传中起主要作用。

酶的阐明是1897年德国化学家布希纳(E．Buchner)从磨碎的酵母细胞中提取出了能使酒精发酵的酿酶开始的。布希纳研究表明，从活体内提取出来的酶能同在活体内一样起作用。不但打击了当时流行的活力论，而且使生物化学的研究进入了解细胞内的化学变化的阶段。后来英国的生物化学家哈登(A．Harden)等对酒精发酵的具体化学步骤作了许多研究。到20年代大量实验结果表明，酵母使糖发酵产生酒精同肌肉收缩时使糖变为乳酸这两个过程基本上是一致的，又称糖酵解作用。到30年代经许多科学家的研究，最后由德国的生物化学家克雷布斯(H．A．Krebs)综合，提出了生物呼吸作用最后产生CO2和H2O及能量(ATP)的三羧酸循环。在此期间还有许多科学家研究了脂肪和氨基酸等的代谢以及糖、脂肪及蛋白质在代谢中相互转化和它们的生物合成等。这些过程均是在酶的催化下完成的。

生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。

这个定义只是概念性的，与生物大分子对立的是小分子物质（二氧化碳、甲烷等）和无机物质，实际上生物大分子的特点在于其表现出的各种生物活性和在生物新陈代谢中的作用。

比如：某些多肽和某些脂类物质的分子量并未达到惊人的地步，但其在生命过程中同样表现出了重要的生理活性。与一般的生物大分子并无二致。

生物大分子大多数是由简单的组成结构聚合而成的，蛋白质的组成单位是氨基酸，核酸的组成单位是核苷酸……

生物大分子都可以在生物体内由简单的结构合成，也都可以在生物体内经过分解作用被分解为简单结构，一般在合成的过程中消耗能量，分解的过程中释放能量。

生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。

这个定义只是概念性的，与生物大分子对立的是小分子物质（二氧化碳、甲烷等）和无机物质，实际上生物大分子的特点在于其表现出的各种生物活性和在生物新陈代谢中的作用。

比如：某些多肽和某些脂类物质的分子量并未达到惊人的地步，但其在生命过程中同样表现出了重要的生理活性。与一般的生物大分子并无二致。

生物大分子大多数是由简单的组成结构聚合而成的，蛋白质的组成单位是氨基酸，核酸的组成单位是核苷酸……

生物大分子都可以在生物体内由简单的结构合成，也都可以在生物体内经过分解作用被分解为简单结构，一般在合成的过程中消耗能量，分解的过程中释放能量。

高相对分子量的生物有机化合物（生物大分子）主要是指蛋白质、核酸以及高相对分子量的碳氢化合物。与低相对分子量的生物有机化合物相比，高相对分子量的有机化合物具有更高级的物质群 。它们是由低相对分子量的有机化合物经过聚合而成的多分子体系。从化学结构而言，蛋白质是由α-L-氨基酸脱水缩合而成的，核酸是由嘌呤和嘧啶碱基，与糖D-核糖或2-脱氧-D-核糖）、磷酸脱水缩合而成，多糖是由单糖脱水缩合而成。由此可知，由低相对分子量的生物有机化合物变为高相对分子量的生物有机化合物的化学反应都是脱水缩合反应。

在原始地球条件下，有两条路径可以达到脱水缩合以形成高分子：其一是通过加热，将低相对分子量的构成物质加热使之脱水而聚合；其二是利用存在于原始地球上的脱水剂来缩合。前者常常是在近于无水的火山环境中进行，后者则可以在水的环境中进行。  

实验四  酵母菌的无机养料（无机养料对酵母菌生长的影响）

一、实验目的

掌握测定酵母菌无机养料的原理以及试验方法。

二、实验原理

酵母所需要的无机物，以磷、钾、镁、硫等为重要。培养酵母这是不可缺少的4种元素。

三、实验器材

   1、菌种：酿酒酵母（酵母菌）

2、培养基：只含氮以及碳化合物培养基（葡萄糖2%，尿素0.5%，豆芽汁1%，琼脂2%）

3、试剂：浓度各为1%的磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化钾溶液

4、器皿：试管、培养皿、接种针、吸管

四、操作步骤

1、用记号笔在空试管上做上标记编号，将斜面酵母菌洗入无菌水制备菌液。

2、每管加培养基10mL并按下表加入各无机物溶液。

  3、试管培养基灭菌后倒平板。并对应编号。

4、用接种针蘸取菌液点种到各平板，每个平板点种3次并且每点就点一下，要做到点种的菌数基本上一样多，这样结果要准确一些。

5、25℃倒置培养一周。

6、观察菌落的有无及宽狭直径大小（mm），以定培养基内养料的丰富或缺乏。

用每两支试管倒一个平板并对应编号→用10ml无菌水稀释酵母菌一支→用接种针接种3点均匀在平板中→28度倒置培养2天→观察结果看菌落生长情况的差异。

五、结果记录

六、思考题

1、酵母菌所需的4种元素，以哪种元素最多？哪种最少？

2、酵母菌所需的无机养料（磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化钾）的情况是怎样的？ 

实验五  营养成分对霉菌生长速率的影响

一、实验目的

了解各种营养元素对霉菌生长速率的影响，并掌握其试验方法。

二、实验原理

霉菌所需要的营养物质通常构成微生物细胞的物质，如碳、氮、氧、氢和各种矿质营养元素，矿质营养元素中以磷含量最高，其次为钾、镁、钙、硫等。为了证实各种重要元素的作用，可将试验菌培养在缺少某一种元素的完全合成培养基上观察对其发育的影响。

三、实验器材

1、菌种：黑曲霉

2、培养基：以霉菌完全合成培养基为基础，制成缺少个别营养元素的各种试验培养基。1000mL蒸馏水加如下物质配成不同的培养基。培养基pH自然。

3、器材：吸管、三角烧瓶、酒精灯、培养箱

四、操作步骤

1、方法一：

（1）制备培养基：学生实验分组配制培养基。培养基分装试管，每管装量5mL，灭菌备用。

（2）孢子悬液制备：取无菌水1支，用接种环从黑曲霉斜面菌种管中挑取菌体2~3环放入水中充分混匀备用。

（3）接种：每组取完全、缺C、缺N、缺P、缺K、缺Zn培养液各一支，用1mL无菌吸管按无菌操作法接种黑曲霉孢子悬液0.5mL。

（4）培养：28℃培养5~7天。

（5）观察结果：培养结束后，观察各培养管中黑曲霉菌丝及孢子生长状况，并将实验结果填入表1。

用10ml无菌水稀释黑曲霉一支菌液→用灭菌的1ml吸管吸取0.5ml黑曲霉菌液接入三角烧瓶培养基中→放入摇床28度培养5天→观察结果称菌丝重量的差异。

2、方法二：

（1）制备培养基：学生实验分组配制培养基。培养基分装100mL三角烧瓶中，每瓶30mLL，每组两瓶，0.1Mpa蒸汽灭菌20min。

（2）接种：冷却后接入供试霉菌孢子。

（3）培养：28℃培养7天。

（4）称干重：用烘干至恒重点滤纸在吸滤瓶中滤出霉菌菌丝体，然后将菌体连同滤纸在60℃烘干，再升至100℃，烘至恒重后称其菌体干重（减去滤纸重量）。

（5）计算：以完全合成培养基培养物的干重作为100%，以求其它缺少个别营养元素的培养基生长物的重量百分比，比数越小，表明缺乏的成分对供试霉菌发育越重要。

五、结果记录

1、表1

    结果表示：++++：生长良好     +++生长较好     ++生长一般     +生长较差     -没有生长

2、表2

六、思考题

1、各营养元素对黑曲霉生长的影响是怎样的？

2、两种测定方法各有什么优缺点？

参考资料：

酵母菌、霉菌常用培养基的配制

一、目的要求

    了解合成培养基、半合成培养基和天然培养基的配制原理。

学习和掌握麦芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基和察氏培养基的配制方法。

二、基本原理

    麦芽汁培养基和马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养酵母菌和霉菌。马铃薯葡萄糖培养基有时也可用于培养放线菌。豆芽汁葡萄糖培养基也是培养酵母菌及霉菌的一种优良培养基。察氏培养基主要用于培养霉菌观察形态用。麦芽汁培养基为天然培养基，马铃薯葡萄糖培养基和豆芽汁葡萄糖培养基二者均为半合成培养基，而察氏培养基则为合成培养基。培养基配方中出现的自然pH系指培养基不经酸、碱调节而自然呈现的pH。

三、实验材料

(一)药品

葡萄搪、蔗糖、NaN0₃、K₂HP0₄、KCl、MgSO₄·7H₂O，FeS0₄、琼脂。

(二)仪器

天平、高压蒸汽灭菌锅。

(三)玻璃器皿

移液管、试管、锥形瓶、烧杯、量筒、培养皿、玻璃漏斗等。

(四)其他物品

药匙、pH试纸、称量纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸、新鲜麦芽汁、黄豆芽、马铃薯等。

四、实验内容

(一)麦芽汁培养基的配制

1．培养基成分

新鲜麦芽汁一般为10-15波林。

2．配制方法

    (1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。

    (2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直至糖化完全(检查方法是取0.5ml的糖化液，加2滴碘液，如无蓝色出现，即表示糖化完全)。

    (3) 糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如仍混浊，可用鸡蛋清澄清(用一个鸡蛋清，加水20 m1，调匀至生泡沫，倒入糖化液中，搅拌煮沸，再过滤)。

   (4)用波美比重计检测糖化液中糖浓度，将滤液用水稀释到10-15波林，调pH至6．4。如当地有啤酒厂，可用未经发酵，未加酒花的新鲜麦芽汁，加水稀释到10-15波林后使用。

    (5)如配固体麦芽汁培养基时，加入2％琼脂，加热融化，补充失水。

    (6)分装、加塞、包扎。

    (7)高压蒸汽灭菌  100 Pa灭菌20 min。

（二)马铃薯葡萄糖培养基的配制

1、培养基成分

马铃薯                                             20g

葡萄糖                                             2 g

琼脂                                               1.5-2g

水                                                 100ml

自然pH                                            

    2．配制方法

    (1)配制20％马铃薯浸汁  取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000m1。80℃浸泡lh，用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。100 Pa灭菌20 min。即成20％马铃薯浸汁，贮存备用。

（2)配制时，按每100 m1马铃薯浸汁加入2g葡萄糖，加热煮沸后加入2g琼脂，继续加热融化并补足失水。

    (3)分装、加塞、包扎。

    (4)高压蒸汽灭菌  100 Pa灭菌20 min。

  (三)豆芽汁葡萄糟培养基的配制

1．培养基成分

黄豆芽                                             10g

葡萄糖                                             5g

琼脂                                               1.5-2g

水                                                 100ml

自然pH                                             

    2．配制方法

    (1)称新鲜黄豆芽10g，置于烧杯中，再加入100 m1水，小火煮沸30 min，用纱布过滤，补足失水，即制成10％豆芽汁。

（2)配制时，按每100 m1 10％豆芽汁加入5g葡萄糖，煮沸后加入2 g琼脂，继续加热融化，补足失水。

    (3)分装、加塞、包扎。

    (4)高压蒸汽灭菌  100 Pa灭菌20 min。

 (四)察氏(czapck)培养基的配制

1．培养基成分

蔗糖                                             3g

NaN0₃                                           0.3g

K₂HP0₄                                                                0.1g

KCl                                             0.05g

MgSO₄·7H₂O                                     0.05 g

FeS0₄                                                                     0.001 g

琼脂                                           1.5-2g

蒸馏水                                         100ml

自然pH                                                

2．配制方法

 (1)称量及溶化  量取所需水量约2／3左右加入到烧杯中，分别称取蔗糖、NaNO₃ 、K₂HP0₄ 、KCl、MgSO_4。依次逐一加入水中溶解。按每100 ml培养基加入1ml 0.1％的FeS0₄溶液。

（2）定容  候药品全部溶解后，将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。

（3）加琼脂  加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。

(4)分装、加塞、包扎。

(5)高压蒸汽灭菌 100 Pa灭菌20 min。

五、实验报告内容

记录你所配制培养基的名称及成分。

实验5-3 酵母菌、霉菌常用培养基的配制

　　一、目的要求

　　了解合成培养基、半合成培养基和天然培养基的配制原理。

　　学习和掌握麦芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基和察氏培养基的配制方法。

　　二、基本原理

　　麦芽汁培养基和马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养酵母菌和霉菌。马铃薯葡萄糖培养基有时也可用于培养放线菌。豆芽汁葡萄糖培养基也是培养酵母菌及霉菌的一种优良培养基。察氏培养基主要用于培养霉菌观察形态用。麦芽汁培养基为天然培养基，马铃薯葡萄糖培养基和豆芽汁葡萄糖培养基二者均为半合成培养基，而察氏培养基则为合成培养基。培养基配方中出现的自然pH系指培养基不经酸、碱调节而自然呈现的pH。

　　三、实验材料

　　（一）药品

　　葡萄糖、蔗糖、NaNO₃、K₂HPO₄、KCl、MgSO₄·7H₂O、FeSO₄、琼脂。

　　（二）仪器

　　天平、高压蒸汽灭菌锅。

　　（三）玻璃器皿

　　移液管、试管、锥形瓶、烧杯、量筒、培养皿、玻璃漏斗等。

　　（四）其他物品

　　药匙、pH试纸、称量纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸、新鲜麦芽汁、黄豆芽、马铃薯等。

　　四、实验内容

　　（一）麦芽汁培养基的配制

　　1．培养基成分

　　新鲜麦芽汁一般为10～15波林。

　　2．配制方法

　　（1）用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6～12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。

　　（2）取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3～4h，使其自行糖化，直至糖化完全（检查方法是取0.5ml的糖化液，加2滴碘液，如无蓝色出现，即表示糖化完全）。

　　（3）糖化液用4～6层纱布过滤，滤液如仍混浊，可用鸡蛋清澄清（用一个鸡蛋清，加水20ml，调匀至生泡沫，倒入糖化液中，搅拌煮沸，再过滤）。

　　（4）用波美比重计检测糖化液中糖浓度，将滤液用水稀释到10～15波林，调pH至6.4。如当地有啤酒厂，可用未经发酵，未加酒花的新鲜麦芽汁，加水稀释到10～15波林后使用。

　　（5）如配固体麦芽汁培养基时，加入2％琼脂，加热融化，补充失水。

　　（6）分装、加塞、包扎。

　　（7）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。

　　（二）马铃薯葡萄糖培养基的配制

　　1．培养基成分

　　马铃薯 20g

　　葡萄糖 2g

　　琼脂 1.5～2g

　　水 100ml

　　自然pH

　　2．配制方法

　　（1）配制20％马铃薯浸汁 取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml。80℃浸泡1h，用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。100Pa灭菌20min。即成20％马铃薯浸汁，贮存备用。

　　（2）配制时，按每100ml马铃薯浸汁加入2g葡萄糖，加热煮沸后加入2g琼脂，继续加热融化并补足失水。

　　（3）分装、加塞、包扎。

　　（4）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。

　　（三）豆芽汁葡萄糖培养基的配制

　　1．培养基成分

　　黄豆芽 10g

　　葡萄糖 5g

　　琼脂 1.5～2g

　　水 100ml

　　自然pH

　　2．配制方法

　　（1）称新鲜黄豆芽10g，置于烧杯中，再加入100ml水，小火煮沸30min，用纱布过滤，补足失水，即制成10％豆芽汁。

　　（2）配制时，按每100ml10％豆芽汁加入5g葡萄糖，煮沸后加入2g琼脂，继续加热融化，补足失水。

　　（3）分装、加塞、包扎。

　　（4）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。

　　（四）蔡氏（Czapck）培养基的配制

　　1．培养基成分

　　蔗糖 3g

　　NaNO₃ 0.3g

　　K₂HPO₄ 0.1g

　　KCl 0.05g

　　MgSO₄·7H₂O 0.05g

　　FeSO₄ 0.001g

　　琼脂 1.5～2g

　　蒸馏水 100ml

　　自然pH

　　2．配制方法

　　（1）称量及溶化 量取所需水量约2/3左右加入到烧杯中，分别称取蔗糖、NaNO₃、K₂HPO₄、KCl、MgSO₄。依次逐一加入水中溶解。按每100ml培养基加入1ml0.1％的FeSO₄溶液。

　　（2）定容 候药品全部溶解后，将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。

　　（3）加琼脂 加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。

　　（4）分装、加塞、包扎。

　　（5）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。

　　五、实验报告内容

　　记录你所配制培养基的名称及成分。

　　六、思考题

　　（一）麦芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基、察氏培养基各常用于培养哪类微生物？

　　（二）在配制麦芽汁培养基时，如何检查麦芽粉水溶液是否糖化完全？

　　（三）何谓培养基的自然pH？

 

 

 

培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素。
按所用原料不同，可分为两类：应用肉汤、马铃薯汁等天然成分配制的，称为天然培养基；应用化学药品配成并标明成分的，称为合成培养基或综合培养基。化学试剂中的培养基，大多为合成培养基。由于液体培养基不易长期保管，现在均改制成粉末。培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须放在2~6。C的冰箱内。

常见培养基有：

1、细菌培养基

配方一 牛肉膏琼脂培养基
牛肉膏0.3克 ，蛋白胨1.0克，氯化钠 0.5克，琼脂 1.5克，
水 100毫升

在烧杯内加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用蜡笔在烧杯外作上记号后，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，加入琼脂，不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后补足失水，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.2～7.6,分装在各个试管里，加棉花塞，用高压蒸汽灭菌30分钟。

配方二 马铃薯培养基

取新鲜牛心（除去脂肪和血管）250克，用刀细细剁成肉末后，加入500毫升蒸馏水和5克蛋白胨。在烧杯上做好记号，煮沸，转用文火炖2小时。过滤，滤出的肉末干燥处理，滤液pH值调到7.5左右。每支试管内加入10毫升肉汤和少量碎末状的干牛心，灭菌，备用。

配方三 根瘤菌培养基

葡萄糖 10克 磷酸氢二钾 0.5克
碳酸钙 3克 硫酸镁 0.2克
酵母粉 0.4克 琼脂 20克
水 1000毫升 1%结晶紫溶液 1毫升

先把琼脂加水煮沸溶解，然后分别加入其他组分，搅拌使溶解后，分装，灭菌，备用。

2、放线菌培养基

配方一 淀粉琼脂培养基（高氏培养基）

可溶性淀粉 2克 硝酸钾 0.1克
磷酸氢二钾 0.05克 氯化钠 0.05克
硫酸镁 0.05克 硫酸亚铁 0.001克
琼脂 2克 水 100毫升
先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2～7.4，分装后灭菌，备用。

配方二 面粉琼脂培养基

面粉 60克 琼脂 20克
水 1000毫升
把面粉用水调成糊状，加水到500毫升，放在文火上煮30分钟。另取500毫升水，放入琼脂，加热煮沸到溶解后，把两液调匀，补充水分，调整pH值到7.4，分装，灭菌，备用。

3、真菌培养基

配方一 萨市（Sabouraud’s）培养基

蛋白胨 10克 琼脂 20克
麦芽糖 40克 水 1000毫升

先把蛋白胨、琼脂加水后，加热，不断搅拌，待琼脂溶解后，加入40克麦芽糖（或葡萄糖），搅拌，使它溶解，然后分装，灭菌，备用。

本培养菌是培养许多种类真菌所常用的。

配方二 马铃薯糖琼脂培养基

把马铃薯洗净去皮，取200克切成小块，加水1000毫升，煮沸半小时后，补足水分。在滤液中加入10克琼脂，煮沸溶解后加糖20克（用于培养霉菌的加入蔗糖，用于培养酵母菌的加入葡萄糖），补足水分，分装，灭菌，备用。

把这培养基的pH值调到7.2～7.4，配方中的糖，如用葡萄糖还可用来培养放线菌和芽孢杆菌。

配方三 黄豆芽汁培养基

黄豆芽 100克 琼脂 15克
葡萄糖 20克 水 1000毫升

洗净黄豆芽，加水煮沸30分钟。用纱布过滤，滤液中加入琼脂，加热溶解后放入糖，搅拌使它溶解，补足水分到1000毫升，分装，灭菌，备用。

把这培养基的pH值调到7.2～7.4，可用来培养细菌和放线菌。

配方四 豌豆琼脂培养基

豌豆 80粒 琼脂 5克
水 200毫升

取80粒干豌豆加水，煮沸1小时，用纱布过滤后，在滤液中加入琼脂，煮沸到溶解，分装，灭菌，备用。

4、食用菌菌种培养基

配方一 马铃薯—蔗糖--琼脂培养基

20%马铃薯煮汁 1000毫升
蔗糖 20克 琼脂 18克

把马铃薯洗净去皮后，切成小块。称取马铃薯小块200克，加水1000毫升，煮沸20分钟后，过滤。在滤汁中补足水分到1000毫升，即成20%马铃薯煮汁。在马铃薯煮汁中加入琼脂和蔗糖，煮沸，使它溶解后，补足水分，分装，灭菌，备用。使用该培养基对pH值要求不严格，可以不测定。

配方二 综合马铃薯培养基

20%马铃薯煮汁 1000 毫升

磷酸二氢钾 3克 硫酸镁 1.5克
葡萄糖 20克 维生素 10毫克
琼脂 18克

先配制20%马铃薯煮汁，方法同上。在煮汁中加入上述各种组分，加热溶解后补足水分，调整pH值到6。分装，灭菌，备用。 该培养基用于培养和保存灵芝、平菇、香菇等食用菌菌种。

5.烟草的培养基
在植物组织培养时,通过调节IAA和CTK的比值能影响愈伤组织分化出根或芽.CTK/IAA高时,愈伤组织分化芽
CTK/IAA低时,分化根;CTK/IAA比例适中维持愈伤组织不分化

愈伤组织诱导培养基制备
以MS培养基母液为基础,向洁净铝锅中顺序加入大量元素20×母液100mL,微量元素100×母液20mL,铁盐100×母液20mL ,维生素100×母液20mL,肌醇200×母液10mL,甘氨酸200×母液10mL,配制得MS培养基后,再加入0.5mg·L-1的BA8mL,0.5mg·L-1的NAA8mL.然后加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水,加入40g蔗糖后搅拌使其溶化,用0.5mol·L-1的NaOH和0.5 mol·L-1的HCl调整pH值至5.8-6.0.加入14g琼脂,将铝锅置于电炉上,搅拌加热使琼脂完全溶化,然后用蒸馏水定容至终体积2L,继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中.

烟草叶片愈伤组织诱导
取一无菌培养皿,用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中,并用解
剖刀将叶片切成2mm2左右的小片,然后将其接种于准备好的培养基上,每瓶接种
5小片,一共接种6瓶.接种后的三角平置于24条件下黑暗培养1周,然后在同
样温度下有光照和全黑暗下培养3周直至愈伤组织形成(两种情况各置3瓶).观
察愈伤组织诱导结果,统计愈伤组织诱导率.

器官分化及植株再生培养
将诱导的愈伤组织按类型分别转入分化培养基上,置于连续光照,温度20-22 C条件下培养3周,统计愈伤组织再生植株情况.

愈伤组织诱导的总体情况
烟草愈伤组织诱导培养4周后,愈伤组织基本形成,即排除因生长时间不够而
未形成愈伤的情况.具体情况见表一中所示,6瓶培养物均有愈伤形成,且都未发
生污染,但诱导率几乎各不相同.其中, 在光照条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为
60.0℅, 在黑暗条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为46.7%.由于实验过程中,外植
体即烟草叶片取得偏小,接种时可能已有部分外植体的大部分细胞脱水死亡,使整
个实验的愈伤组织诱导率偏低,愈伤块偏小.
特殊培养基：
一 选择性培养基
1酵母菌富集培养基
葡萄糖5% 尿素0.1% 硫化铵0.1% 磷酸二氢钾0.25% 磷酸氢二钠0.05% 七水合硫酸镁0.1% 七水合硫酸铁0.01% 酵母膏0.05%
孟加拉红0.003% pH4.5
2 Ashby无氮培养基 富集好养自生固氮菌
甘露醇1% 磷酸二氢钾0.02% 七水合硫酸镁0.02% 氯化钠0.02%
二水合硫酸钙0.01% 碳酸钙0.5%

二 鉴别培养基
EMB培养基，常用于鉴别E.coli
蛋白胨 10g 乳糖5g 蔗糖5g 磷酸氢二钾2g 伊红Y 0.4g 美蓝0.065g
蒸馏水1000g pH7.2

分离海洋微生物的培养基配方

2216E培养基配方（固体培养基）
蛋白胨 5克
酵母膏 1克
磷酸高铁 0.01克
琼脂 15-20克
陈海水 1000毫升
煮沸氢氧化纳（5%）的溶液调PH值7.6—7.8  

实验六 鉴定细菌的微量、快速生化试验

一、实验目的

1、了解鉴定细菌的微量、快速生化试验原理。

2、学习有关试验方法。

二、实验原理

此法是将预先吸附有各种生化底物的圆形滤纸片放在塑料反应板的圆孔内，再加入少量培养液和处于对数生长期的高浓度菌液（30亿~40亿/mL），在37℃恒温箱中培养数小时，细菌就能产生足够量的生产化物，出现反应结果。

该方法与常规法比较有以下有点：①快速性，在数小时内即可观察结果。②准确性，它与常规法进行比较总符合率达95%以上。③灵活性，可制备含各种生化底物的圆形滤纸片，当进行菌种鉴定时可根据需要选用。而且制备好的滤纸片烘干后，将它装入塑料袋中（或瓶内）扎紧口袋，放冰箱中可保存1个半月。因此，该法比常规快速、简便且节省材料和人力。

结果判断与常规法相同，除少数试验须加试制后才能判断结果外，其余试验均可根据细菌生长后各培养液颜色的变化来判断。

三、实验器材

  1、菌种：大肠埃希氏菌、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）。

2、微量生化反应用培养基

     ① 糖发酵培养基：蛋白胨水100mL，1%溴麝香草酚蓝1mL。

     ② 丙二酸盐试验、柠檬酸盐试验、尿素分解试验：用pH6.8溴麝香草酚蓝磷酸缓冲液。配制方法如下：将0.07mol/L磷酸氢二钠溶液等量混合，加水稀释3倍。每100mL缓冲液中加1mL 1%溴麝香草酚蓝。

     ③ 吲哚产生、硫化氢产生、MR反应和VP反应等试验：使用蛋白胨水培养基，其成分是蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL。上述培养液于121℃下灭菌20min。

3、含生化底物滤纸片的制备

①含糖纸片：称取各种糖（醇）0.9g，分别溶于2mL蒸馏水中。

②含尿素纸片：称尿素1.5g溶于2mL蒸馏水中。

③ MR和VP反应纸片：称葡萄糖1.6g，磷酸氢二钾0.5g，溶于2mL蒸馏水中。

④丙二酸钠纸片：硫酸铵0.2g，丙二酸钠0.3g，溶于2mL蒸馏水中，pH调至7.0。

⑤柠檬酸钠纸片：柠檬酸钠0.7g，硫酸镁65mg，溶于2mL蒸馏水中。

⑥硫化氢试验用纸片：硫代硫酸钠0.25g，糊精0.5g，硫酸亚铁80mg，半胱氨酸50mg，2×牛肉膏蛋白胨培养液2mL，待各成分溶解后，pH调至7.4。

⑦苯丙氨酸纸片：L-苯丙氨酸0.25g（或DL-苯丙氨酸0.5g），溶于2mL蒸馏水中。

上述各种溶液置水浴中加热溶解，然后分别取300张无菌的滤纸片（直径6mm）浸于各溶液中，待充分吸附后，取出置无菌培养皿中（或瓷盘中），并放到37℃恒温箱中干燥。待干燥后，将含不同生化底物的圆形纸片分别装入塑料袋中，扎紧袋口，放冰箱中保存，备用。

四、操作步骤

1、制备菌液：将待检验的菌株预先活化后，接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，在37℃恒温培养8~12h，然后用生理盐水洗下菌苔制成每毫升含6×（10⁹~10¹⁰）幼龄菌液，或从平板上挑数个单菌落于3.5mL生理盐水中制成菌悬液。

2、反应板消毒：用75%乙醇消毒4×12孔有机玻璃或陶瓷U型反应板，每孔容量约1mL。

3、标记菌名及生化试验项目：在塑料反应板上注明各孔的生化试验项目及被检细菌。

4、加滤纸片：将含不同生化底物的圆滤纸片放入相应的圆孔内。

5、加培养液：用无菌滴管分别吸取各种培养液于相应孔内，各孔内加培养液4滴（约0.5mL）。苯丙氨酸孔内加生理盐水4滴。

6、加菌液：于各孔内各加菌液1滴（0.05~0.1mL），最后在糖发酵孔内加少许熔化的石蜡，用以观察糖发酵后是否产气（如产气，则石蜡层会自培养基表面裂开）。

7、培养：将反应板放入装有少量水的有盖搪瓷盘中，以防止培养液被蒸发干。然后置37℃恒温培养4-8h，取出反应板并观察记录结果。个别迟缓反应可延长至20h再记录1次。

8、观察记录：

（1）糖发酵：若呈黄色且石蜡层裂开，则表明该菌能利用某糖既产酸又产气，以⊕符号表示。如仅产酸以“＋”表示。若培养液保持原色则表示该糖不被利用，以“－”表示。

（2）MR反应、VP反应、吲哚反应和苯丙氨酸脱氨酶试验：按常规法加入试制后观察结果。

五、结果记录

将微量生化试验结果记录于下表中

注意事项：

1、加各种成分于塑料圆孔中时要避免产生气泡。

2、尿素分解，苯丙氨酸脱氨反应进行较快，2-4h即可出现明显结果，应及早观察。柠檬酸盐利用反应较迟缓，大多要8~20h才能完成。

3、VP反应加入试制后要充分混匀，最好用冷吹风机在反应板上方5~10cm处对着试验孔吹风5次，以加速反应。

六、思考题

1、微量生化试验方法具有哪些优点？

2、该试验方法为何能在数小时内得到反应结果？

参考资料

一、 实验目的
1． 了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法。
2． 通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况了解细菌碳、氮代谢类型的多样性。
3． 了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。

二、 实验原理
　　各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映了它们是有不同的酶系统。
　　细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：第一、使自然界所有的有机分子都有可能得到分解；第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础，例如，一种微生物能利用另一种微生物所分解的产物。
另一方面，微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一,细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方法来利用，可以鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。

三、实验仪器、材料和用具
1．实验仪器
37℃恒温培养箱、20℃恒温培养箱。
2．微生物材料
大肠杆菌，产气杆菌，枯草杆菌，变形杆菌。
3．培养基
1） 葡萄糖发酵培养基的试管和乳糖发酵培养基的试管各3支，每支5～10ml。
2） 葡萄糖蛋白胨水培养基3支，每支5～10ml。
3） 胰蛋白胨水培养基3支，每支5～10ml。
4） 醋酸铅的半固体培养基3支，每支5～10ml。
5） 营养明胶培养基3支，每支5～10ml。
6） 柠檬酸钠培养基3支，每支5～10ml。
4．试剂
甲基红试剂，吲哚试剂，V.P.试剂。
5．用具
试管，无菌平皿，杜氏小管，酒精灯，记号笔，试管架，接种环等。

1、快速性，在数小时内即可观察结果。2、准确性，它与常规法进行比较总符合率达95%以上。3、灵活性，可制备含各种生化底物的圆形滤纸片，当进行菌种鉴定时可根据需要选用。而且制备好的滤纸片烘干后，将它装入塑料袋中（或瓶内）扎紧口袋，放冰箱中可保存1个半月。因此，该法比常规快速、简便且节省材料和人力。

结果判断与常规法相同，除少数试验须加试制后才能判断结果外，其余试验均可根据细菌生长后各培养液颜色的变化来判断。

材料和器皿：

  1、菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）,产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）,普通变形杆菌（Proteus vulgaris）。