关键词
缺血再灌注损伤自由基清除 抗凝血剂
摘要
目的：大量自由基的产生可能是造成缺血再灌注损伤的主要原因之一。MDA(1,1,3,3-四甲氧基丙烷)
是脂质过氧化的最终产物，常用来作为评价大鼠心肌缺血再灌注损伤的指标。NNP是一种新合成的五肽缀合物，具有自由基清除和溶栓的双重活性。在这项研究中我们拟考察NNP是否对心肌缺血再灌注损伤有一定的保护作用。
方法：大鼠左冠状动脉阻塞30分钟，然后再灌注120分钟。NNP(10mg/kg)
或溶剂在缺血模型形成之前10分钟经颈静脉给药。再灌注结束后，快速取出心脏进行生化测定和病理组织学分析。
结果：缺血再灌注损伤之后MDA水平明显升高，GSH水平明显降低；NNP给药组显示MDA明显降低和GSH升高；另外，NNP给药组心肌的梗死面积明显减小。
结论：实验结果显示，氧化应激可造成缺血再灌注损伤，NNP可使梗死面积明显减小，并明显改善心脏抗氧化能力，从而缓解脂质过氧化造成的缺血再灌注损伤。对心脏缺血再灌注损伤的保护作用可能源于NNP的自由基清除和溶栓的双重活性。
心肌缺血再灌注损伤是一个严重的，而又无法避免的问题。尽管对器官保护的加强和外科技术的提高，缺血再灌注损伤依然是临床面临的一个重要问题，对于它的防治具有重要意义，增强器官的抗氧化能力可能是减轻缺血/再灌注损伤的治疗方法。
根据这些，我们在研究中使用了一种新型合成的药物（NNP）（N-[1-（1，，3，-Dioxyl-4，,4，,5，5，-tetramethyldihydro-imidazol-2-yl）phenyl-4-yl]oxyacetyl-GRPAK）,
以往的研究表明，它具有自由基清除剂的活性和血栓溶解剂的活性，希望在预防给药中，能够减轻缺血再灌注损伤。
材料与方法
1．实验分组
雄性wistar 大鼠24只，体重250-300g ,
饲养于安静的动物室内，温度控制在21±2℃，湿度控制在60±5%。实验分为3组：空白对照组；缺血再灌注+溶剂组；缺血再灌注+NNP组。溶剂和10mg/kg
NNP在缺血前10分钟静脉给药。每组取8只大鼠用来测定心肌梗死面积和组织GSH（还原型谷胱甘肽）和MDA(1,1,3,3-四甲氧基丙烷)的水平。NNP用乙醇溶解，最终用生理盐水稀释至1%。
2．缺血-再灌注模型制备程序
大鼠腹腔注射1.2-1.4g/kg乌拉坦麻醉，颈静脉插管以备给药，气管插管进行人工呼吸，颈总动脉插管，并通过Harvard model
50-8952传感器（Harvard Apparatus,Inc., Massachusetts,
U.S.A.）测定血压，采用Harvard Universal 笔式记录仪（Harvard
Apparatus,Inc., Massachusetts,
U.S.A.）显示心电图。左侧于第4，5肋间开胸，并立即进行人工呼吸（1.5ml/100g，
60次/分）以保证pCO2、pO2和PH值正常。剪开心包，微微挤压使心脏暴露，6/0手术线快速置于左冠状动脉下，然后使心脏归位，稳定20分钟。外端手术线通过小塑料套管置于心脏内，拉动外端手术线头，可形成动脉阻塞，如放开则形成再灌。如果稳定过程中动物出现心律失常、血压持续下降到70mmHg以下，弃去不用。
3．组织死亡评价
动脉阻塞30分钟，然后再灌注120分钟。在缺血再灌之前的过程中监测血压、心电图、心率的变化。实验结束后，快速取出心脏，悬挂于Langendoff装置上，以生理盐水室温下灌流60秒。冠脉再次阻塞，然后灌注荧光染料，以标记梗死区（非荧光染料区域）。冰冻心脏，从心尖处开始,
把心脏横向切成4片，厚2mm.，将第2片起的切片，投入液氮中，并在-70℃保存，以备生化分析。为了评价组织死亡，切片置于1%
氯化四唑（TTC）中，
37℃孵育20分钟。非梗死区被染成深红色，而坏死区不着色，梗死区和危险区在紫外灯下不发出荧光。梗死区和危险区体积通过面积乘以切片厚度表示。梗死面积按文献报道方法，以占危险区百分数表示[2]。
4．生化测定
心脏标本在冰冷的150mM KCL
中匀浆，用来测定MDA。通过分光光度法测定上清中MDA，以硫代巴比妥酸激活底物百分率表示。GSH以分光光度法测定，采用ELman,s试剂。结果以nmol/g组织蛋白表示。
结 果
1.在实验前后，对照组与给药组之间平均动脉压和心率均没有显著差别。
在缺血或再灌注过程中，NNP给药组对血液动力学参数没有明显的影响（见表1）
表1 血液动力学指标
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分组
稳定后
局部缺血后
再灌注30、60、120分钟
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|
血压 (mmHg)
|
|
I/R+溶剂组
88±5
74±4
82±4
88±3
86±5
|
|
I/R+NNP组(10mg/kg)
78±4
67±5
76±3
83±3
81±3
|
|
心率 (次/分)
|
|
I/R+溶剂组
309±10
367±14
320±12
324±11 332±14
|
|
I/R+NNP组(10mg/kg)
315±12
326±13
328±13
330±15 322±11
|
2.各组危险区、梗死面积和梗死面积/危险区比率。结果显示，NNP给药（10mg/kg,缺血前）能显著降低梗死率。（见表2）
表2 心肌梗死面积测定
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组别
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危险区 (cm3)
|
梗死面积 (cm3)
|
梗死面积/危险区 (%)
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I/R+溶剂组
|
47±5
|
23±3
|
50±4
|
|
I/R+NNP组(10mg/kg)
|
48±2
|
17±2a
|
35±2a
|
3．缺血/再灌注组MDA水平显著高于对照组，NNP能够显著降低MDA
数值的升高。缺血/再灌注组GSH水平低于对照组，NNP能够明显升高GSH水平。（见表3）
表3 NNP处理前后GSA、MDA水平测定
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组别
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GSH (nmol/g)
|
MDA (nmol/g)
|
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对照组
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670±40
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56±6
|
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I/R+溶剂组
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460±23
|
144±10 a
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I/R+NNP组 (10mg/kg)
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789±137 b
|
50±30 b
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4．统计
数值均以平均值±标准差表示。每组n=8。I/R表示缺血/再灌注，a表示与对照组相比有显著差别（P＜0.001，b表示与NNP给药组相比有显著差别(P＜0.02
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