自噬体的检测对研究自噬尤为重要
(2010-11-17 07:31:41)
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溶酶体酸性磷酸酶透射电子显微镜检测绿色荧光蛋白自噬autophagy杂谈 |
分类: 自噬 |
自噬体的检测对研究自噬尤为重要:
①以透射电子显微镜下超微结构的形态学检测(俗称检测自噬体的金指标)。在透射电镜下可见损伤的细胞器如线粒体的肿胀变性,其周围出现空泡状双层膜样结构、继而双层膜环绕成自噬体、进而与溶酶体融合,消化,也可见自噬溶酶体内最终不能降解的残体等。
②自噬体膜标志性蛋白质的检测。自噬体膜上标志性蛋白质有Apgl2-Apg5结合体和微管相关蛋白1的轻链3(LC3)。Apgl2和Apg5在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起,它定位在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段。LC3是酵母菌自噬基因(Apg7/Apg8)在哺乳动物中的同源物,和前者相比,LC3除了定位在自噬体分隔膜上,也一直以和磷脂酰乙醇胺即脑磷脂(PE)结合的形式(LC3-PE)存在于自噬体形成各阶段的内外膜上,在自噬溶酶体膜上也可见。通过与绿色荧光蛋白(GFP)结合成Apgl2-Apg5-GFP、LC3-GFP,即可实现对自噬体的检测。
④间接自噬体检测法。自噬溶酶体及其不能降解的产物—残体的检测。自噬体和溶酶体融合后,除上述的LC3-GFP法检测外,还有吖啶橙染色法。它是一种荧光染料作为非极性反胶态分子团的分子探针,在自噬溶酶体内酸性磷酸酶活性增强下显著着色。对残体的检测主要是对脂褐素颗粒的显微观察。
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