加载中…【专题讨论】Autophagy（自噬）----心荷
(2010-11-11 07:20:20)
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细胞死亡溶酶体荧光显微镜线粒体基质自噬pdα-synautoph杂谈 |
分类： 自噬 |
【专题讨论】Autophagy（自噬）
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（一）自噬诱导剂 1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激 2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶） 3）Earle's平衡盐溶液：制造饥饿 4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂 5）Rapamycin：mTOR抑制剂 6）Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂 （二）自噬抑制剂 1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂 2）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂 3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂） 除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。 细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有： 1）观察自噬体的形成 由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV） 2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成： 由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。 3）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成： 自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。 （Note：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。） 4）检测长寿蛋白的批量降解：非特异 5）MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。 6）CellTrackerTM Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。 在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位： Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。 LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。 pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。 MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。 Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。 Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔 【Note：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS处理】 自噬与细胞死亡经常需一起考虑，下面介绍一些检测细胞死亡的方法： （1）△ψm dissipation（线粒体跨膜电位的消失）：TMRM发红色荧光，DiOC6（3）发绿色荧光。 （2）Phosphatidylserine Externalization（磷脂酰丝氨酸外翻）：Annexin V-FITC（绿色）染细胞膜，（3）检测线粒体产生的ROS：无荧光的HE（hydroethidine，氢化乙啶）可被ROS氧化为EthBr（ethidium bromide，溴乙啡啶），发红色荧光。NAO（nonyl acridine orange，烷化吖啶橙，可发荧光）能与非氧化的cardiolipin（心磷脂，可被ROS氧化）反应而失去荧光。 （4）线粒体IMS蛋白的释放：AIF，细胞色素c，分别用荧光二抗染色。 （5）Capase 3a 染色：用荧光二抗染色，胞浆弥散分布。 （6）细胞膜完整性检测：DAPI（蓝色）、Hoechst 33342或PI（红色）染核。胞膜完整的细胞（活细胞和早中期凋亡细胞）排斥，可联用annexin V。 【如何用实验区分Cell death by autophagy和Cell death with autophagy】 第一步：利用上述方法证实细胞死亡 第二步：证实细胞死亡前发生了自噬 第三步：在形态学上区别开“自噬样死亡”与凋亡 第四步：利用遗传学手段（反义RNA干扰Knockdown掉Atg基因或hVps34）或工具药抑制自噬 第五步：细胞存活则为Cell death by autophagy，反之，细胞死亡则为Cell death with autophagy。 |
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