自噬及其在神经变性疾病中的作用

摘要：自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象，它与细胞的生长发育进程以及多种疾病的发生发展密切联系。调控自噬的分子和信号传导途径错综复杂，作为Ⅱ型程序性死亡，自噬与凋亡相互作用，参与了细胞稳定状态的维持和疾病的发生。近来的研究表明，自噬在神经变性疾病的发生发展过程中发挥着重要的作用。

关键词：自噬；程序性死亡；神经变性疾病；凋亡

[Abstract]

    自噬是真核细胞内降解胞质细胞器和长寿命蛋白质的一种溶酶体途径，它与降解短寿命蛋白质的泛素依赖的蛋白酶体系统一起在细胞的新陈代谢中发挥着至关重要的作用。损伤和营养缺乏时，机体可通过自噬降解受损的蛋白质和细胞器来提供能量并消除潜在的毒素而使细胞得以生存，但自噬的过度激活也参与了一些疾病的致病过程。以往研究表明，自噬是恶性肿瘤、感染、免疫监督和神经退行性病变中决定细胞生存或者死亡的一个重要机制^[1-3]。目前，有关自噬及其在神经变性疾病中的作用的研究引起了人们极大的兴趣。

1 自噬的概念与分类

     早在1962年，Ashford和Porten就已提出细胞中存在“self-eating(自食)”，并将这一现象命名为“autophagy(自噬)”，但之后很长时间内自噬并没有引起人们的广泛关注。直到近10年随着分子生物学的发展，首先在酵母中发现了参与自噬的分子机制，随后在哺乳动物细胞中也发现了相似的机制，对自噬的研究这才有了重大进展。自噬是胞浆大分子物质和细胞器在裂解腔隙中大量降解的涉及亚细胞膜重构的非选择性动力学过程。与其他生命途径相比，自噬过程经历的时间较短(为8 min)，这表明它是细胞对环境变化的有效反应。自噬可分为3种形式：大自噬      (macroautophagy)，小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone—mediated autophagy，CMA)。大自噬的发生过程通常分为3步：(1)饥饿或激素等因素刺激下独立双层膜结构的形成; (2)双层膜的延伸、部分细胞成分的包绕及自噬体的形成; (3)细胞骨架驱动下自噬溶酶体的形成及包含物的降解^[4]。自噬体的直径一般为300～900 nm，平均为500 nm。在此过程中，自噬体的形成是其关键步骤。小自噬的发生是溶酶体膜内陷直接包裹细胞物质进入溶酶体内发生降解。而CMA则不发生囊泡转运，胞质内的某些特定蛋白先被一个分子伴侣复合物识别，然后在溶酶体膜上的特异受体的作用下，被转运到溶酶体腔中消化。

2　自噬的分子机制

持生噬的活性和是降解胞质成分，使其在营养受限时得以循环利用。自噬机制具有保守性，在高等真核生物中的机制与酵母中的类似。大自噬是自噬的主要形式，具有许多典型特征，关于它的研究也较为全面。大自噬起始于自噬体膜对包含蛋白质的细胞浆的局部隔离。有关自噬体膜的来源说法不一，目前认为，粗面内质网的非核糖体区域、高尔基体及一种未知来源的吞噬体膜(phagophore)都可能是其来源^[5，6]。许多自噬相关基因（ATG）都参与了自噬体的形成，而ATG的产物―自噬相关蛋白（Atg）则在自噬体形成时能共同发挥作用。其中，Atg12-Atg5和Atg8这两个泛素样结合系统的作用尤为关键，是自噬体膜延长和自噬正常发生的重要机制^[7，8]。自噬体所转运的物质在自噬体与溶酶体融合后可进入溶酶体内发生降解，而自噬体与溶酶体的融合要求许多与其它空泡转运相同的因子参与其中。分子基因研究表明，同型空泡融合的机制也适用于此融合过程。自噬的主要目的是降解胞质成分，使其在营养受限时得以循环利用，而降解要求空泡内呈酸性pH环境以及蛋白酶B（Prb1）和Cvt17的参与。

自噬过程可被TOR（target of rapamycin）激酶调控，它可通过两个机制抑制自噬：其一，TOR可作为信号传导级联，通过其下游因子调控转录和翻译^[9]；其二，TOR可直接或间接作用于Atg蛋白，影响自噬体的形成^[10]。哺乳动物细胞中存在TOR的类似物mTOR（mammalian target of rapamycin），它以一种类似酵母中的机制调控自噬。胰岛素，磷脂酰肌醇3激酶-Ⅰ（PI 3 K-Ⅰ）/PKB和自噬性蛋白降解的终产物氨基酸都参与了mTOR的调控机制。另外，mTOR信号途径的调控同自噬的活性及细胞外的营养状况也密切相关^[11]，如果细胞外的营养获得不足，那么自噬就会被诱导发生以维持ATP生成和生物合成所需要的代谢池。

小自噬的特征较少，因此其具体机制到目前为止并不是很清楚，最近的报道显示，一个空泡转运伴侣（the Vacuolar Transporter Chaperone ，VTC）复合物参与了小自噬的分子机制，是小自噬发生所必需的，且此复合物的缺失将阻断小自噬的发生。CMA则与大自噬和小自噬不同，它并不发生囊泡转运，含特定KFERQ五肽模序的蛋白质首先可选择性地被以热休克蛋白70(heat shock 70 kDa protein，hsc70)为主的分子伴侣复合物识别，然后在溶酶体膜上的受体lamp2a (1ysosome associated membrane protein type 2a)的作用下，被转运到溶酶体腔中消化。许多神经病理学中发现的异常蛋白质如淀粉样前蛋白，synuclein等均包含此五肽模序，可通过CMA被降解清除。

3　自噬的功能

自噬具有双重功能，一方面它可降解异常蛋白质，防止其在神经元内蓄积；另一方面自噬作用若过度活跃则会损伤细胞器，如造成线粒体功能障碍等，从而可能对细胞有害，参与神经退行性疾病的致病过程。

3．1自噬的保护作用

自噬可连续不断地降解和再利用细胞成份，对维持细胞内环境的稳定具有十分重要作用。在营养缺乏或疾病状态时，自噬很可能是一种细胞防御保护机制，通过降解细胞内容物来提供能量、合成新的蛋白质，同时还能消除损伤线粒体和一些凋亡相关因子，从而保护细胞免于或延缓死亡。已有报道显示，在选择性敲除ATG7基因导致自噬被阻断的小鼠模型中，肝细胞内出现了损伤的线粒体和泛素阳性聚集物^[12]，提示阻断自噬，受损的线粒体则不能被及时消除。随着年龄的增长，溶酶体功能和自噬的效率逐渐下降，这也在一定程度上解释了为何老化会增加与异常蛋白积聚相关的神经退行性疾病的危险性。

3．2自噬性细胞死亡（autophagic cell death, ACD）

自噬是一种防御机制，但在某些环境下它又充当了一个细胞死亡途径。神经元脑显影的形态学研究认为这是一种程序性细胞死亡，它的典型特征是出现双层膜的自噬小泡，自噬小泡中包裹有细胞内蛋白质或细胞器，一开始细胞骨架和完整的核是保留的，直到最后过程才消失。这种形态学形式被称为Ⅱ型程序性细胞死亡即自噬性细胞死亡，它与Ⅰ型程序性细胞死亡即凋亡有着不同的机制^[13]。凋亡细胞骨架崩溃，细胞皱缩，染色质凝聚，DNA断裂，细胞形成凋亡小体，Caspase被活化，残余的细胞被吞噬细胞的溶酶体消化。凋亡一般通过2种途径来活化Caspase。作为神经元细胞通常使用的一条内在途径是依靠线粒体作为起始因子活化Caspase9；另一个外在的途径是通过细胞外死亡配位体（肿瘤坏死因子和Fas）活化Caspase8和10^[14]。而自噬性死亡则无Caspase的活化，且能被其选择性抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3MA ）所抑制。

大量体内外研究表明，自噬同凋亡在同种组织中可同时发生，并且自噬可能是凋亡的一个触发因素。例如，果蝇唾液腺中的发育的细胞死亡，可能被考虑是一种ACD，现在大家都知道涉及凋亡基因及caspase。干扰素-γ诱导的宫颈癌细胞系的自噬性细胞死亡需要Atg5蛋白^[15]，而Atg5过表达则会诱导自噬泡（Autophagic Vacuoles, AV）积聚和细胞死亡。上述两种实验情况下，抑制自噬可阻断自噬泡形成从而阻止了细胞死亡；然而，用Z-VAD抑制Caspase阻断了细胞死亡而并不能阻止AV积聚，提示自噬的活化能促发凋亡。自噬抑制剂3－MA在活体外情况下可通过阻断自噬来保护细胞，如氯喹处理的皮层神经元，神经生长因子丧失的交感神经元及丧失血清和K+的小脑颗粒细胞。在这些情况下，3-MA阻止或者延缓了几乎所有的细胞死亡，细胞死亡包括ACD和细胞凋亡，因此自噬能触发凋亡并可能起到协同作用^[16]。

5 自噬与神经变性疾病

自噬可降解异常蛋白质，防止其在神经元内蓄积，在神经变性疾病中有重要的作用。帕金森病（Parkinson’s disease,PD），老年痴呆（Alzheimer’ disease,AD）和亨廷顿氏舞蹈病（Huntington’s disease,HD）等神经变性疾病中常见有错误折叠蛋白质的异常聚集，但异常蛋白积聚和神经毒性作用发生的很晚，这可能与自噬效率逐渐衰退有关，大自噬和CMA都可延缓正常老化。近来研究报道显示，自噬基因敲除的小鼠，可诱导神经退行性变和泛素化蛋白质的积聚^[17,18]。另外，一些致神经变性疾病的基因突变会损害蛋白水解酶系统，而这个系统对降解突变蛋白有重要作用，这种情况下，自噬在神经变性疾病中的作用就变的更加重要。目前，对自噬的研究已成为神经变性疾病的一个新的热点。

5．1 PD

细胞内的Lewy小体是PD的特征性病理改变，研究表明，α-synuclein蛋白参与了Lewy小体形成，与多巴胺神经元变性有关。在PD患者，黑质多巴胺神经元的死亡同α-synuclein的积聚有关，α-synuclein的积聚不仅具有神经毒性作用，且对突触功能和信号的传递也有影响。作为一个多因素的疾病发展过程，PD中的细胞死亡形式极为复杂：具有凋亡，坏死的特征和类自噬结构的积聚^[19]。大量研究表明，自噬参与了α-synuclein的代谢过程：野生型α-synuclein蛋白的降解是通过CMA进行的，它含有CMA识别模序，可被以hsc70为主的分子伴侣复合物识别，与溶酶体上的受体lamp2a结合并转运至溶酶体内；而突变型α-synuclein虽然也可与lamp2a结合，且比野生型α-synuclein蛋白的结合更为牢固，但它并不能被转运进溶酶体腔中被溶酶体酶降解。另外，突变α-synuclein蛋白与lamp2a的结合，也影响了其他通过CMA降解的蛋白质如野生型α-synuclein和甘油醛-3-磷酸脱氢酶等蛋白的有效降解。当α-synuclein过表达时，大自噬常常被诱导来弥补CMA缺陷，而积聚的囊泡不能被完全酸化或提供cathepsin D^[20]，提示自噬溶酶体的融合受损。

5．2 AD

最近的研究发现AD中存在着显著的自噬功能紊乱^[20，21]，为该病溶酶体系统机能障碍提供了新的证据。自食泡逐渐积聚，成为占主导地位的细胞器，形成的巨大的肿胀的营养不良的神经炎是AD的神经病理学标记^[21]。其中大部分的自食泡是自噬体，而在正常脑组织这些结构很少看到。他们的存在反映了自噬的激活，且值得注意的是损害自噬溶酶体的成熟可减低蛋白质的降解率。近来，自噬被认为同AD的关键致病因子β-淀粉状蛋白的产生有关。大部分由自噬形成的β-淀粉状蛋白通常在溶酶体内被降解，但在AD病人的脑组织中，β-淀粉状蛋白在Av池中积聚并形成了一个主要的细胞内毒素储存器。溶酶体内的β-淀粉状蛋白使得Av膜不稳定，并且促进水解酶释放到细胞浆中^[22]。胆固醇载体载脂蛋白E的变异体e4是AD疾病的一个重要危险因子，它可加剧这种膜损伤。ApoE-e4被内吞后被降解成为片段能使溶酶体膜不稳定并导致蛋白酶释放。

   Aβ-淀粉状蛋白的产生同淀粉样蛋白前体丰富的细胞膜的循环和一种罕见的分泌酶复合物的强化有关。这种酶能将APP转化成Aβ。由基因编码的早老素-1是分泌酶复合物的一种组成部分，对大部分遗传性早发AD病例负有重要责任。早发AD中早老素-1的突变可引起溶酶体受损，β-淀粉状蛋白积聚和神经元细胞丢失。这些关于疾病发展的突变早老素-1的效应和附加效应增加了神经元的损伤，最终诱导了凋亡。通过观测可以部分的理解为当自噬被诱导时，早老素-1被转移到这些囊泡膜上并可能参与了自噬的调控^[21]。支持这种观点的论据是在缺乏基因编码的早老素1和2的囊泡中，可观测到一些蛋白质的折叠错误，且其积聚沉积在囊泡中。早老素突变导致的大自噬功能的丧失会使细胞对凋亡易感并引起β-淀粉状蛋白沉积。

5．3 HD

HD的主要病症是不受控制的大肢体运动，伴有认知障碍和精神异常，它是亨廷顿蛋白(Huntingtin，Htt)发生突变，在细胞内的过度蓄积而引发的疾病，其病变是纹状体投射性γ-氨基丁酸神经元和大脑运动皮层锥体细胞过早死亡。Htt在细胞内的蓄积能激活自噬／溶酶体系统。Qin等^[23]发现抑制自噬会减少细胞的存活率，增加细胞中突变Htt蛋白的聚合，激活自噬则可减少Htt的蓄积和Htt聚合体的形成。自噬活性是随着年龄增长而逐渐降低的，成年后自噬能力较低，在老年期则更低。而舞蹈病多在中年以后发病，这可能与越来越低水平的自噬不能有效清除突变的Htt蛋白，导致神经元受累有关。另外，研究还指出Htt蓄积诱导的自噬伴随着caspase-3的激活和大量线粒体的受损，正是这些作用可能最终导致了神经元的功能障碍，在HD疾病晚期过度活跃的自噬可能参与了舞蹈病的致病机制。

6 结语

自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象，它与细胞的生长发育进程以及多种疾病的发生发展密切联系。目前对自噬的研究方兴未艾，但有关自噬起源，信号传导以及其对细胞生存的影响都还不是很清楚。例如在神经变性疾病中，自噬对神经元的死亡到底起了一个什么作用仍有待于进一步阐明。相信随着对自噬更深入的研究，揭示自噬的具体机制及其相应的调控因子能够为神经变性疾病提供一个新的治疗靶点。