实验目的:

1、掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法

2、了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术

实验原理:           

高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动是，经过反复多次的吸附－解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。

仪器和试剂:

1.    岛津液相色谱(SCL-10AVP)

微量注射器 10μL、1μL各1支

2．苯、甲苯、色谱醇、甲醇

实验步骤

1.调好最佳色谱条件，控制柳树为1ml/min。柱温30℃，检测波长354nm

2．苯，甲苯定性分析

在最佳条件下，用微量注射器分别进样1μL试样，1μL苯标液和1μL甲苯的标液(注射器用甲醇润洗3～5遍)观察其记录保留时间，确定苯和甲苯的峰。

3．苯、甲苯定量分析

在最佳条件下，用微量注射器分别进样1μL/mL、2μL/mL、3μL/mL、4μL/mL、5μL/mL的标液。观察记录保留时间和峰面积。根据峰面积在工作曲线上查出苯和甲苯待侧液的浓度，并计算试样中苯和甲苯的含量。

结果与讨论:

1.数据分析报告

1）定性分析

 

 

 

 

苯

甲苯

 

单 标

 

 

 

 

化合物	保留时间（min）
苯	4.008
甲苯	4.707

 

 

 

2)定量分析

①      色谱图

1 ul/ml

5 ul/ml

②标准曲线

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Y = aX + b a = 1396338；b = 0.0 R^2 = 0.9925280 R = 0.9962570	Y = aX + b a = 2472848；b = 0.0 R^2 = 0.9983730 R = 0.9991862
苯	甲苯

 

③      未知样品

 

保留时间	浓度	峰面积
4.189	3.15	5583319
4.834	3.26	8366194

 

色谱条件：   Phenomenex ODS 柱

流动相：90% 甲醇-水，流速：1ml/min，检测波长：254 nm

2．讨论：

1．高效液相色谱法的特点

特点：高压、高效、高速、高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。

2．在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。

采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。

3．选择流动相时应注意的几个问题

（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。

（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。

（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。

（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。

4．影响分离的因素与提高柱效的途径

1）．液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径，降低固定相粒度可提高柱效。

2）．液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质；（恒温）

3）．改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。

5. 高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点：
(1)进样方式的不同：高效液相色谱只要将样品制成溶液，而气相色谱需加热气化或裂解；
(2)流动相不同，在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力；
(3)由于液体的粘度较气体大两个数量级，使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动相中约小4~5个数量级；
(4)由于流动相的化学成分可进行广泛选择，并可配置成二元或多元体系，满足梯度洗脱的需要，因而提高了高效液相色谱的分辨率（柱效能）；
(5)高效液相色谱采用5~10Lm细颗粒固定相，使流体相在色谱柱上渗透性大大缩小，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相；
(6)高效液相色谱是在液相中进行，对被测组分的检测，通常采用灵敏的湿法光度检测器，例如，紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光光度检测器等。

6．  高效液相色谱的定性和定量分析的方法

定性：①利用纯物质定性的方法

利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。

利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。

②利用文献保留值定性

相对保留值r21：相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。

定量：有归一法、内标法、外标法

在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等，但高效液相色谱在分离复杂组分式样时，有些组分常不能出峰，因此归一化法定量受到限制，而内标法定量则被广泛使用。

7．本实验的定量分析方法要在这样的情况下才能使用

本试验采用外标法进行定量分析，对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。