随着去除核糖体测序技术深入发展，越来越多的环状RNA（circRNA）不断报道发现，基于生物信息学分析显示circRNA发挥着极其重要的生物学功能。然后如何采用实验手段进一步验证circRNA的生物学功能显得尤为重要，为此小编特别邀请技术部刘建宁老师，带大家一起探讨circRNA功能验证策略。

• circRNA定量验证

circRNA定量验证手段与常规PCR手段不同，常规手段是围绕目的片段的上下游分别设计PCR引物，称之为convergent primer，需扩增的片段位于上下游引物之间（如图1.1）。而对于circRNA，尤其外显子环化circRNA，除backsplice junction位点处不同于linear RNA之外，body区与linearRNA是一致的。因此，验证时需要特异性针对backsplice junction位点处设计primer，称之为divergent primer（如图1.1），而且设计的PCR product的长度越短越好，可以增强backsplice junction位点处扩增效率。

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图1.1 convergent primer vs divergent primer

为增强circRNA的验证效率，起始模版需满足以下要求（3 free）：1. DNA free；2. rRNA free；3. linearRNA free。

验证策略：对3free RNA以及genome DNA同时进行PCR扩增，电泳检测PCR product大小（如图1.2）。

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图1.2 circRNA引物扩增结果

• circRNA Northern blot验证

Northern blot方法是一种比较古老但行之有效的序列验证方法，需围绕circRNA设计探针序列，而探针序列设计是验证成功至关重要的环节。对于circRNA探针设计，我们建议以下两点：1. 对于外显子环化circRNA，建议探针尽可能跨backsplice junction位点；2.对内含子环化circRNA，可围绕内含子区域设计探针。

验证策略：对3 free RNA、total RNA以及genome DNA同时进行杂交验证。

• circRNA过表达

circRNA过表达思想主要源于circRNA生物形成机制，已有多篇文章报道circRNA成环机制，目前比较公认的成环机制为circRNA侧翼序列的碱基互补配对，称之为Alu结构（如图2）。

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图2 circRNA侧翼结构特征

基于circRNA侧翼Alu序列特征，PCR扩增含侧翼Alu序列的目标DNA序列，随后依据对应限制性内切酶位点进行酶切，进而连接pEGFP-C1载体。连接载体进而转染对应细胞样本，定量PCR检测转染效率。基于divergent primer验证circRNA过表达倍数。

过表达策略：1. 扩增目标区域包含circRNA侧翼Alu序列或内部碱基互补序列，侧翼上下游1kb处过表达效率更佳；2. 目标区域扩增基于基因组DNA为模版。

• circRNA敲除

circRNA敲除思路主要针对circRNA backsplice junction处序列信息设计siRNA，对于内含子环化circRNA，也可针对内含子区域设计相应siRNA进行干扰。Divergent primer验证circRNA敲除倍数。

敲除策略：

1. 外显子环化circRNA，针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA，如图3所示；

2. 内含子环化circRNA，除针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA序列以外，也可针对内含子区域序列设计siRNA。

3. 每个siRNA设计对应的对照，backsplice junction位点一端互补配对，另一端错配，如图3所示。

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图3 基于siRNA敲除策略

参考文献

1. New Phytologist (2015) doi: 10.1111/nph.13585.
   

2. Nature Structural&Molecular Biology (2015) doi:10.1038/nsmb.2959.

3. RNA (2013) 19:141–157.

4. Cell Reports (2015) 10, 170–177.