最近发现大家关心的问题是：bowtie用法、samtools用法、miRNA研究方法。下面我(流泪鱼)来给大家阐释一些个人的理解。
常见的短序列比对工具有很多，如fasta、blast、bowtie、shrimp、soap等。每个工具都有其自身的优点，但同时也具备了一些缺点。权衡利弊，我选择bowtie作为主要的短序列比对工具。它速度很快，比对结果也容易理解。
现在举个例子来探讨bowtie的使用方法：现在有GENOME.fa、高通量测序数据Reads.fa，我们希望将Reads.fa比对到基因组GENOME.fa上。
（一）、对Reference文件(GENOME.fa)建库

建库步骤可能需要1h甚至几个小时，建议在后台执行：
nohup bowtie-build GENOME.fa GENOME.fa &

（二）、将Reads.fa比对到GENOME.fa上，只能比对到正链，且匹配到基因组不多于20个不同位置，允许有1个错配

• 注：
• -f 指定query文件为fasta格式
• -a 保留所有比对结果
• -m 指定最大比对到基因组的次数
• -v 允许最大错配数，为[0-2]
• --al 能map到GENOME的reads，fasta格式
• --un 不能map到GENOME的reads，fasta格式
• --norc 不输出匹配到负链的结果；如果不想输出比对到正链的结果，则用"--nofw"。不指定该选项则正负链结果都输出
• 后面依次写上GENOME索引文件，Reads文件，输出结果文件Reads.bwt，日志文件log。

（三）、bowtie输出结果的说明

• 1. query id
• 2. "+"表示正向match；"-"表示对query作反向互补后match
• 3. reference id
• 4. 第2列为"+"时，表示query 第一个碱基map到reference(5'->3')上的位置，0-based(以0开始)；第2列为"-"时，表示query的反向互补序列第一 个碱基map到reference(5'->3')上的位置，0-based(以0开始)
• 5. 如果第2列为"+"，则和query序列一致；否则，和query序列反向互补
• 6. 质量文件，如果query文件为fasta格式，则无法获取质量文件，用I代替，I的数量与query序列长度一致
• 7. 当前query能map到GENOME的4个不同位置
• 8. 如果存在第8列，表示有mismatch。第8列可以分为三个部分，最左端的数字，中间的碱基为reference碱基，最右端的碱基为query碱基，下面分情况讨论：

• 第2列为"+"时：最左端的数字9表示query从5'端数起，第10个碱基为"T"，而对应的reference为"G";
  第2列为"-"时：最左端的数字9表示query先作反向互补，然后从3'端数起，第10个碱基为"T"，而对应的reference为"G";