核酸的提取、纯化和浓缩

1.核酸的提取

    核酸都溶于水，而不溶于有机溶剂，利用此性质进行提取。在细胞内DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（RNP），在不同浓度的盐溶液中它们的溶解度差别很大，DNP在纯水或1 mol/LNaCl溶液中溶解度较大，但在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度很低，相反，RNP易溶解。因此，用0.14mol/LNaCl溶液可简单地初步分开DNP和RNP。
    在分离核酸中最困难的是将核酸与紧密结合的蛋白质分开，而且还要避免核酸的降解。常用的解离剂是阴离子去垢剂，如脱氧胆酸钠，十二烷基硫酸钠（SDS），４－氨基水杨酸钠和萘－1，5－二磺酸钠等，它们具有溶解病毒、细菌的作用，可使核酸从蛋白质上游离出来，还具有抑制核糖核酸酶的作用。另外除去核酸中的蛋白质的一个有效办法是用酚－氯仿混合液，它们可使蛋白质变性，并对核糖核酸酶有抑制作用，另外氯仿比重大可使有机相和水相完全分开，减少残留在水相中的酚。在用酚－氯仿抽提核酸提取液时，还须要剧烈振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，在酚－氯仿抽提液中再加上一定量的异戊醇。
2. 核酸的纯化
   核酸的纯化最关键步骤是去除蛋白质，通常只要用酚／氯仿、氯仿抽提核酸的水溶液即可。每当需要把DNA克隆操作的某一步所用的酶灭活或去除以便进行下一步时，可进行这种抽提。然而，如果从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸，则要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提。这些广谱的蛋白酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶Ｋ等，它们对多数天然蛋白质均有活性。
    用酚／氯仿抽提：这两种有机溶剂合用，比单独用酚抽提除蛋白效果更佳。继而用氯仿抽提则可除去核酸制品中的痕量酚。具体步骤如下：
    ①核酸样品置有盖小离心管中，加入等体积的酚／氯仿；②旋涡混匀管内容物，使呈乳状；③12000ｇ室温离心15ｓ；④水相移入另一离心管，弃去两相界面和有机相；⑤重复步骤①～④，直至两相界面上无蛋白质为止；⑥加入等体积的氯仿并重复②～④步操作；⑦按下述核酸浓缩法沉淀回收核酸。
3.核酸的浓缩

    应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成的核酸沉淀可经离心而回收。甚至对低至ｐｇ（皮克）量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液中。具体操作时，可向含样品的小离心管中加入单价阳离子盐贮存液。单价阳离子盐的选择，主要基于下述考虑：用醋酸铵可减少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化时应避免用醋酸铵，因铵离子是多核苷酸激酶的强烈抑制剂。当用较高浓度的乙醇沉淀RNA时，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不随核酸共沉淀。含有SDS的核酸样品，应使用NaCl，这时该去垢剂在70％乙醇中仍保持可溶。
    DNA和RNA的沉淀，大多使用醋酸钠（pＨ5.2）。