第四章  蛋白质的共价结构

一、蛋白质通论

二、肽

三、蛋白质的一级结构的测定

四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能

本章重点及习题解答

 

一、蛋白质通论

蛋白质（protein）是最重要的生物大分子，在生物体内占有特殊位置。

最简单的生命体仅仅由蛋白质和核酸构成。

许多蛋白质已经被分离纯化，并获得晶体。

通过研究这些蛋白质，揭示了蛋白质的化学组成、结构和功能。

 

（一）蛋白质的化学组成

蛋白质是一类含氮有机化合物，各种元素在蛋白质中的组成百分比约为：  

蛋白质的平均含氮量为16%，这是蛋白质元素组成的特点，也是凯氏（Kjedahl）定氮法测定蛋白质含量的计算基础。

蛋白质含量（克%）=蛋白氮×6.25　    式中6.25即16%的倒数，为1克氮所代表的蛋白质量（克数）

 

（二）蛋白质的结构

蛋白质由多肽链折叠而成，具有特定的空间结构和生物学功能。

蛋白质的空间结构，即蛋白质的构象，指蛋白质的所有原子在三维空间（x、y、z）的位置。

由于蛋白质结构的复杂性，需要对蛋白质的结构作剖析描述。

 

1⁰结构：指蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序。

2⁰结构：指蛋白质多肽链主链的折叠方式。

3⁰结构：指蛋白质一条多肽链的折叠。

4⁰结构：指寡聚蛋白中各亚基的空间排布。

 

（四）蛋白质的进化

（五）研究蛋白质结构与功能的方法

 

二、肽(peptide)

（一）肽和肽键的结构：

     一个氨基酸分子的α-羧基与另一个氨基酸分子的α-氨基在适当的条件下经脱水缩合形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。

     组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。

      凡氨基酸残基数目在50个以上，且具有特定空间结构的肽称蛋白质；凡氨基酸残基数目在50个以下，且无特定空间结构者称多肽。

 

蛋白质是相对分子量很大的生物分子。

蛋白质分子量的上下限是人为规定的，一般下限为胰岛素（分子量5700)。

蛋白质相对分子量≈残基数×110

 

1、肽键形成

在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序；

通常在多肽链的一端含有一个游离的a-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的a-羧基，称为羧基端或C-端；

氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。                 

肽的命名从氨基端（N－端）的残基开始，氨基端在结构式的最左边。

2、肽单位空间结构的特点

1）肽单元是刚性平面，组成肽单元的六个原子都处于同一平面。

       肽键平面——由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，构成刚性平面结构，这一平面称为肽键平面或肽单元。

2）肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转。

3）由于α-碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平面可以作相对旋转。

4）在肽单位上，羰基氧和亚氨基氢（或两个Cα)呈反式构型。

 

肽链的重复单位：（N-Cα-C）n

 

（二）肽的物理和化学性质

肽的酸碱性：主要决定于肽键中的游离末端的α－NH₂、游离末端α－COOH及侧链R基上的可解离功能团；

长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链上的。

 

（三）天然存在的活性肽：

       在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。

       此外，生物体内还有很多活性肽（active peptide)以游离状态存在，这类多肽分子量较小，具有各种特殊的生理功能。

多肽类激素：种类较多，生理功能各异。主要见于下丘脑及垂体分泌的激素。

神经肽（neuropeptide）: 在神经传导过程中起信号转导作用的肽类。

谷胱甘肽（GSH）：

       全称为γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。其巯基可氧化、还原，故有还原型（GSH）与氧化型（GSSG）两种存在形式。

      

谷胱甘肽的生理功用：

       解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；

       参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；

       保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态；

       维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。

 

抗菌肽(Antimicrobial peptide):

       抗菌肽是生物体内产生的一种具有抗菌功能的小分子多肽，具先天性免疫功能，由20～60个氨基酸残基组成，分子量一般在2000～7000Ｄ左右。

       抗菌肽具有分子量小、热稳定性强、水溶性好、抗菌谱广、杀菌活力高及原料来源丰富等特点和优势。

       抗菌肽对某些真菌、原生动物，尤其对耐药性细菌有杀灭作用，有望开发成新一代的抗生素。

       抗菌肽还能选择杀伤肿瘤细胞，抑制乙型肝炎病毒的复制。

 

三、蛋白质一级结构的测定

蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。 

 

（一）、测定蛋白质的一级结构的要求

1，样品必需纯（>97%以上）；

2，知道蛋白质的分子量；

3，知道蛋白质由几个亚基组成；

4，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。

5，测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。

 

（二）、蛋白质一级结构的测定测定步骤

1、多肽链的拆分;

由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。

如：血红蛋白（四聚体）可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。

 

2、测定蛋白质分子中多肽链的数目;

通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。

 

3、二硫键的断裂

几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的b-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。

可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价键；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。

 

4、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；

 

5、分析多肽链的N-末端和C-末端;

       多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。

       在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。

（1）、N-末端分析：

  a)2,4-二硝基氟苯（DNFB，称Sanger试剂）法；

  b)丹磺酰氯（DNS）法;

  c)异硫氰酸苯酯（PITC）法：Edman降解法，最初用于N末端分析；

　d)氨肽酶法。

 

a)二硝基氟苯（DNFB）法

Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP-肽）。

在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。

b)丹磺酰氯法（DNS法）：

原理与DNFB法相同。在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。DNS－氨基酸水解后不需要提取，可直接用纸电泳或薄层层析加以鉴定。

此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，灵敏度比DNFB法高100倍，检测灵敏度可以达到1?0^-9mol。

 

c)异硫氰酸苯酯（PITC法）：

Edman降解法，最初用于N末端分析。N末端氨基酸生成PTH－氨基酸(苯乙内酰硫脲氨基酸)，在268nm有最大光吸收，可用层析技术鉴定，剩下n－1个残基的肽链可参加第二轮反应，n轮反应就能测出n个残基的顺序。

Edman氨基酸顺序分析法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。

 

d)氨肽酶法

氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。

根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。

最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。

 

（2）、C-末端分析：

①　肼解法：

目前测定C端残基的最重要的化学方法。

多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成二苯基衍生物沉淀而与C-端氨基酸分离。

C末端氨基酸以游离形式存在，可用FDNB法或DNS法及层析技术进行鉴定。

 

②　羧肽酶法：

羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。

目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。

羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。

　　使用羧肽酶分析末端时，要注意不可混入内肽酶，否则会造成结果的混乱。

 

6、多肽链的部分断裂：采用特异性的酶或化学试剂将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来（至少做两套）。

 

 酶解法：

胰蛋白酶（trypsin），常用，专一性强，只断裂Lys或Arg的羧基参与形成的肽键。

糜蛋白酶（chymotrypsin）：即胰凝乳蛋白酶。断裂Phe,Trp,Tyr等疏水氨基酸的羧基参与形成的肽键。

胃蛋白酶(pepsin)：断裂键两侧残基都是疏水性氨基酸。

金黄色葡萄球蛋白酶：又称Glu蛋白酶，在Glu和Asp残基的羧基侧断裂肽键。

梭状芽孢杆菌蛋白酶：或称Arg酶，专门裂解Arg残基的羧基所形成的肽键。

 

 化学裂解法

溴化氰断裂：只断裂由Met残基的羧基参加形成的肽键。因Met含量少，因此CNBr裂解产生的肽段不多。

羟胺断裂：NH₂OH专一性地断裂-Asn-Gly-之间的肽键，但专一性不强。因出现几率低，故所得肽段很大。

 

7、分离纯化单一肽段。肽段混合物用凝胶过滤，凝胶电泳，离子交换层析，高效液相色谱，高效薄层层析等方法进行分离提纯。

8、测定每个肽段的氨基酸顺序;

 

9、确定肽段在多肽链中的次序;

     利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。

拼凑两套水解方案得到的肽片段序列，得到多肽的完整序列

 

10、 确定原多肽链中二硫键的位置;

一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，

再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，

然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。

 

蛋白质相关数据库

 

四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能

（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化

         同源蛋白质、细胞色素c、系统树

（二）同源蛋白质具有共同的进化起源

         氧合血红素蛋白质、丝氨酸蛋白酶类

（三）血液凝固与氨基酸序列的局部断裂

         血液凝固中的级联过程、凝血酶和血纤蛋白原在血凝中的作用、血纤蛋白溶解系统（纤溶系统）            

 

据估计，蛋白质以某个恒定的速率进化，同源蛋白质序列差异程度与种系进化过程中的歧化时间成正比。

相关种属的相同蛋白质的序列间存在相似性，称为序列同源性。

具有序列同源性的蛋白质称为同源蛋白质，同源蛋白共有的相似序列称为共义序列。

人类细胞色素c的氨基酸顺序

图示人和其他物种细胞色素c的氨基酸序列比较，有27个残基是不变的，用红色表示，推测它们最重要，与细胞色素c的生物学功能有关。蓝色阴影部分表示保守型取代；未加阴影的是非保守取代；Ｘ是稀有氨基酸（三甲基赖氨酸）

细胞色素c的进化树

 

本章重点：

蛋白质的基本结构

蛋白质的一级结构及其测定

知识点：

1、蛋白质含量的测定和计算；

2、肽和肽键的结构；

3、多肽的化学性质及等电点计算；

4、蛋白质的序列测定（部分蛋白酶的酶切位点和和化学试剂的断裂位点；N，C端-氨基酸残基的测定、二硫键定位、根据实验结果推测蛋白质的序列）

 

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