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重组单株和QTL克隆！
(2007-10-24 21:50:51)
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知识/探索 |
分类： 科普文章 |
QTL的精细定位和克隆已经是常规技术，也是研究热点，当然我们实验室也不例外，目前做这方面研究的同学也不少。海南播种在及，我发现大家在准备播种材料，分析数据时，常常犯一些基本常识错误，简单来说，是遗传学的基本知识不过关。
在已经有了BC3，4F2大群体后，进一步种植重组单株的目的是什么，什么有是重组单株？这些基本概念需要弄清楚，我们的研究才可能不走或少走弯路，这里我以我们实验室的一个研究为例子，明确几个概念，希望对大家有帮助：
背景知识：
1）目前已经把一个控制株高（包括其他性状）的QTL定位在标记M17-M2-M3之间，3个标记之间遗传距离是3.8-0.7cM.
如何确认基因在这三个标记之间，这也是一个基本的也是重要的遗传学问题！
2）目前用的是681个单株的BC5F2群体，这个群体理论上能够把基因定位到什么程度，大家可以考虑一下！
显然对于BC5F2群体，因为每个基因型只有一个单株，表型鉴定不是很准确（目前看来对玉米尤其是这样），还无法根据表型直接把QTL分解为孟德尔因子，需要对重组单株进一步进行种植，根据后代表现确定基因型。
因为已经确认基因在这3个标记之间，所以如果这3个标记都是1（假设是低亲的基因型），那么毫无疑问，目标基因的基因型也是1（双交换的概率非常低，对目前小群体可以忽略,<4/10000），如果都是2，那么基因的基因型也是2，都是3，基因的基因型也是3。但对于那些122，123，等三个标记不是完全一样的单株，我们如何确定基因的基因型呢？如果表型足够准确，可以直接根据表型判定，但对玉米看来比较难，这就要对这些单株（这就是重组单株）的后代进行进一步的检测。如一个单株基因型是122，其BC5F3后代表型非常低（和低亲一致），则说明目标基因在该单株为1，同时也可以判定基因位于标记M1和M2之间。如果后代表型都很高，则说明基因在M2之后，其基因型为2，但不能判定在M2之前还是之后！还需要其他单株的情况来证明。如此类推，可以根据后代的表型判断上代单株目标基因的基因型。从而把QTL转换成孟德尔（1，2，3）因子，就可以直接把基因作为一个标记，而准确的予以定位！所以，小高海南播种的目的，是根据后代判断那些不能直接判断上代基因型单株的基因型！所以需要种植的材料就是这3个标记表现分离的单株！同时种植低亲作为对照！目的是确定基因在哪2个标记之间和计算遗传距离，并进一步开发标记精细定位，还不能够克隆。
3）图位克隆一个QTL的基本思路：
3.1
比如利用一个BC5F2的大群体，目前实验室的做法是所有单株都取DNA，然后开发标记去定位，这实际上加大了工作量3倍！通常的做法是，取群体的阴性单株DNA进行标记筛选。如小高的群体，理论上应该有3/4是高的，1/4是低的，那么只要对这些1/4单株取样（其基因的基因型都是1），然后围绕附近开发标记。比如一共找到1000株这样的矮单株，有一个标记在990个单株都是1，而有1个单株是2，说明该标记和该基因的大约距离是10/1000=1cM(这里是大约，还要转换，这个数字告诉我们要对一个QTL进行精细定位或者克隆，需要一个非常大的群体！如果要达到0.1cM,
平均要4000个单株才能找到一个重组单株！）。这种方法，在水稻等自交物种中比较好操作，因为其田间试验比较准确（请从事相关研究的同学细读张启发老师TAG关于GS3QTL克隆的文章，所谓细读就是要把其中每个细节弄清楚，刻在脑子里，细读过的可以来和我交流心得）；或者说，对那些绝对效应值比较大的性状，能够在群体中直接看到3：1的分离，比较容易操作！对目前小高这个QTL，尽管其效应值也高达20厘米，但是田间试验对玉米株高的误差很容易在10厘米以上，所以这种办法不可行！
3.2
另外一个办法就是，在种子或苗期就开始对DNA进行筛选，假设我们已经找到基因两侧的两个标记与基因的距离分别是1cM,
我们用这两个标记对种子或苗子进行筛选，都表现为1，或都表现为2或者3的不要（尽管里面有出现双交换的可能，概率是1/100*1/100=1/10000），我们可以直接判定这些单株的基因型，对那些两个标记表现不同的单株保留下来进行田间种植和进一步的后代试验确定其目标基因的基因型。从而可以直接把基因定位到一个比较小的范围或者拿到基因。这样大约在10000粒种子里可以找到200左右这样的单株（单交换单株），这样田间试验就非常容易操作。对于玉米而言，这种办法尤其好用，因为我们可以直接从种子里提取DNA，而种子可以继续保证发芽，即使只有80%的成功率，也是值得的！请小高等同学认真考虑，这几乎是你操作10000株以上大群体的唯一办法，如果种到地理，提DNA对于你来说工作量太大！田间实验也不可能准确！
（请相关同学，熟读去年SCIENCE关于脱粒QTL克隆的文章，尤其是其补充的材料方法，就是对水稻苗期直接进行筛选，大约筛选了12000颗苗子，请大家注意，该文章的作者只有3个人！science
311: 1936-1939）
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