疑难问题：搞清楚限制性核酸内切酶的作用特点，了解了质粒的作用，接来就产生了一个很重要的问题，即如何防止切割后线性载体分子的自身环化？以前一直认为只有双酶切法，学习了相关的资料，还了解了其它常用的方法。

要阻止在限制酶切割后线性载体分子的自身环化作用，具体可采用以下方法：

1、用非同尾酶进行双酶切

用不同的限制酶（非同尾酶，双酶切）切割载体和插入DNA，而且形成不同的黏性末端，能连接，也能确定方向，这种模式被广泛应用。

 

2、用碱性磷酸酶处理限制酶酶解产生的线性载体分子

碱性磷酸酶可除去线性载体DNA 分子的5¹-磷酸，而留下3¹-羟基基团。经过碱性磷酸酶处理的线性载体分子，除非插入外源DNA 片段，否则就不能重新环化为有功能的载体分子。

3、采用同聚物加尾连接技术

切割后形成的线性DNA 分子的两个3¹-OH末端，此时都已被加上具有同样碱基结构的同聚物尾巴。

 

4、应用柯斯质粒

所谓柯斯质粒，乃是一类由人工构建的含有λ DNA的 cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。

在连接反应中，正确配加载体DNA 与外源DNA 间的比例，是高效获得重组体的一个重要因素。在应用λ噬菌体或柯斯质粒作载体时，如果配置高比值的载体DNA /外源DNA 的连接反应体系，就有利于重组体分子的形成；在应用质粒作载体时，因为其重组体分子是由一个载体分子和一个外源DNA 片段环化而成的，所以当载体DNA 与外源DNA 的比例为1时，最有利于重组体分子的形成。