CRISPR位点结构图

疑难问题：选考试题中出现了CRISPR/Cas9基因编辑技术，这也是学科热点，考试要求中确实有学科热点的考向，适当地进行拓展也是生物学科的特点，有必要进行学习和延伸。今天学习了《SciLondon的个人博客》（科学网），有了大概了解，学习并摘录整理成我作为高中生物教师能理解的知识，略去了具体操作的机理，因为太难懂了。

一、名称来源和组成

CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，充当了防御外源遗传物质的“基因武器”。

CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列（上图展示了完整的CRISPR位点的结构）。

其中，CRISPR序列由众多短而保守的重复序列区和间隔区组成。重复序列区含有回文序列，可以形成发卡结构。而间隔区比较特殊，它们是被细菌俘获的外源DNA序列。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。而在上游的前导区被认为是CRISPR序列的启动子。

另外，在上游还有一个多态性的家族基因，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（CRISPR associated，Cas）。目前已经发现了Cas1-Cas10等多种类型的Cas基因。

Cas基因与CRISPR序列共同进化，形成了在细菌中高度保守的CRISPR/Cas系统。

二、CRISPR/Cas9技术应用

CRISPR/Cas是进行基因编辑的强大工具，可以对基因进行定点的精确编辑。

在向导RNA和Cas9蛋白的参与下，待编辑的细胞基因组DNA将被看作病毒或外源DNA，被精确剪切。

CRISPR/Cas技术应用

1、基础应用之一－基因敲除

如果在基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，

Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。

而生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。

2、基础应用之二－替换或者突变

如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒（供体DNA分子），这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变。这样就可以实现基因的替换或者突变。

3、其他应用

对受精卵细胞进行基因编辑，并将其导入代孕母体中，可以实现基因编辑动物模型的构建。

随着研究的深入，CRISPR/Cas技术已经被广泛的应用。除了基因敲除，基因替换等基础编辑方式，它还可以被用于基因激活，疾病模型构建，甚至是基因治疗。