教材研究：亚硝酸盐含量的测定通常有种方法，教材中出现的是分光光度法测定亚硝酸盐，即用盐酸萘乙二胺分光光度法测定亚硝酸盐的含量。该方法具有应用广泛、灵敏度高、选择性好、准确度高、分析成本低、操作简便、快速的特点。

一、关于亚硝酸盐

亚硝酸盐俗称“硝盐”，是含氮化合物的一类。常见的亚硝酸盐有亚硝酸钾和亚硝酸钠，为白色或淡黄色结晶或颗粒状粉末，味微咸，易溶于水，多成白色晶体，密度大于水，硬度较大，十分易碎，外观极似食盐。并广泛存在于自然环境中尤其是在气态水、地表水和地下水中以及动植物体与食品内。

亚硝酸盐可用于印染、漂白等行业，并广泛用作防锈剂，是建筑业常用的一种混凝土掺加剂。在一些食品如腊肉、香肠等中，也常加入少量亚硝酸盐作为防腐剂和增色剂，不仅能防腐，而且还能使肉的色泽鲜艳。但是，亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质，它可诱发人体胃癌、肝癌、食道癌等疾病，过量或长期食对人的身体会造成危害，甚至死亡。

二、亚硝酸盐中毒机理

亚硝酸盐是强氧化剂，进入血液后与血红蛋白结合，使氧和血红蛋白变为高铁血红蛋白，从而失去携氧能力，导致组织缺氧，从而出现一系列缺氧的中毒病症，严重时可使人死亡。另外亚硝酸盐对周围血管有扩张作用。

三、实验目的

学会使用分光光度法测定亚硝酸盐的含量；绘制亚硝酸盐标准曲线。

四、实验原理

试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫色染料，外标法（以待测成分的对照品作为对照物质，相对比较以求得供试品含量）测得亚硝酸盐含量。反应式如下：

五、实验试剂

1．氯化铵缓冲液：在1L玻璃烧杯中，加入500mL水，准确加入20.0mL盐酸，混匀，准确加入50mL氨水，必要时用稀盐酸和稀氨水调试至PH9.6-9.7。

2．硫酸锌溶液（0.42mol/L）:称取120g硫酸锌（ZnSO47H2O）用水溶解并稀释至1000mL。

3．氢氧化钠溶液（20mol/L）:称取20g氢氧化钠用水溶解，稀释至1000mL。

4．对氨基苯磺酸溶液：称取1g对氨基苯磺酸，溶于70mL水和30mL冰乙酸中，置棕色瓶中混匀，室温保存。

5．N–1-萘基乙二胺溶液：称取0.1g N-1-萘基乙二胺，加60%乙酸溶液，并稀释至100mL，混匀后，置棕色瓶中，在冰箱中保存，一周内稳定。

6．显色剂：临用前将N-1-萘基乙二胺溶液和氨基苯磺酸溶液等体积混合。

7．亚硝酸钠标准溶液：准确称取0.2500g于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水溶解移入500mL容量瓶中，加100mL氯化铵缓冲液，加水稀释至刻度，混匀，在4℃避光保存。此溶液每毫升相当于500ug的亚硝酸钠，作储备液。

8．亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液1.0mL置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5.0ug亚硝酸钠。

六、问题与讨论

1．样品处理过程中，硫酸锌溶液的作用是什么？

答：与氢氧化钠反应，产生氢氧化锌沉淀，吸附杂质，包括使蛋白质沉淀。

2．加硫酸锌产生沉淀后，为什么要水浴加热？

答：进一步让蛋白质沉淀。

3．测定来硝酸盐过程中，氯化铵和乙酸的作用是什么？

答：重氮化反应要在酸性条件下进行。氯化铵和乙酸会形成醋酸铵-醋酸缓冲对溶液，溶液维持酸性，重氮化过程稳定。

附：香肠中亚硝酸盐的测定步骤

1．称取10g左右的火腿于研钵中，用量筒量取70mL的水，加入一部分于研钵中，将其研成肉糜状。

2．将肉糜状的火腿转移至烧杯中，用剩下的水冲洗研钵，一同倒入烧杯中。加入12mL氢氧化钠溶液，用玻璃棒搅拌均匀。

3．测量液体的pH值，若其大于8，则将烧杯中所有物质转移至250mL容量瓶中；若小于8，则再加氢氧化钠直至大于8为止。

4．加入10mL硫酸锌溶液，混匀，容量瓶中出现为乳白色的乳浊液。

5．放入60℃的水浴锅中加热10min。

6．取出，用流水冷却，加水定容。然后静置30min。

7．出去容量瓶中的上层脂肪，然后用漏斗过滤，弃去初始的20mL滤液。但是要全部过滤完得出滤液的总体积。

8．制作标准曲线：吸取0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0，2.5，5，10，15，20，25ug亚硝酸盐）分别置于25mL容量瓶中分别加入4.5mL氯化铵缓冲液，加2.5mL60%乙酸后，立即加入5.0mL显色剂，加水至刻度，混匀，在暗处静置25min，用1cm比色杯（灵敏度低可换2cm比色杯），以零管调节零点，于波长550nm处测吸光度，绘制标准曲线，求出回归方程。