疑难问题：高考和模拟试题中出现了流式细胞仪检测细胞周期，很多学生包括老师对这方面了解很少，如何检测？甚至在检测时到底是所有的DNA还是核DNA？

（2015年北京高考试题）流式细胞仪可根据细胞中DNA含量的不同对细胞分别计数。研究者用某抗癌药物处理体外培养的癌细胞，24小时后用流式细胞仪检测，结果如图。对检测结果的分析不正确的是

A．b峰中细胞的DNA含量是a峰中的2倍

B．a峰和b峰之间的细胞正进行DNA复制

C．处于分裂期的细胞均被计数在a峰中

D．此抗癌药物抑制了癌细胞DNA的复制

【答案】C

【解析】从题目图中我们不难看出有两个峰值细胞的数目最多，分别对应的DNA含量为40和80。可知40的应该是处于分裂间期的细胞，因为间期时间比较长。而80的细胞应该是属于分裂期的细胞，DNA含量已经加倍。因此A选项中b峰中细胞的DNA含量是a峰中的2倍是正确的。B选项中a峰和b峰之间应该是细胞周期中的S期，正在进行DNA分子复制。C选项中，处于分裂期的细胞DNA含量处于加倍状态，应该计数在b峰中。D选项通过看右侧图可知b峰明显下降，可知应该是抑制了DNA分子的复制，DNA加倍的细胞明显减少，所以D选项正确。 

流式细胞仪是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。

流式细胞仪，又称荧光激活的细胞分选器，作为进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体力学、图像技术、细胞生物学、免疫学理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为生物医学实验室的“CT”。流式细胞术已经成为一种用途最广泛和最先进的细胞分析技术，在细胞生物学、血液学、肿瘤学、免疫学等基础和临床医学领域发挥着重要作用。
流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由流动室与液流系统、激光源与光学系统、光电管与检测系统、计算机与分析系统四部分组成。

一、流式细胞仪的检测细胞周期的原理（PI染色法）

细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为三期：即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。某些细胞在分裂结束后暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，执行一定生物学功能（G0期）。

由于细胞周期各时相的DNA 含量不同，通常正常细胞的G1/ G0 期具有二倍体细胞的DNA含量（2N），而 G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量（4N） ,而S期的DNA 含量介于二倍体和四倍体之间。PI可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。因此，通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0 期，S 期和G2/M 期,获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。

PI，即碘化丙锭，可以与细胞内DNA和RNA结合。PI 不能通过细胞膜完整的细胞（如活细胞和早期凋亡细胞），在标本制备时，必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性，才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。乙醇通常为终浓度为70 %的冷乙醇。

如果应用于流式，采用RNA抑制剂将RNA消化后 ，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。当然，PI也可用于作细胞核染色，作为观察或定量细胞的方法。

二、流式细胞仪的工作原理

首先将待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色（间接免疫荧光染色或直接免疫荧光染色）后加入样品管中，在气体压力推动下进入流动室，流动室内充满鞘液，在鞘液的作用下，细胞排成单列从流动室喷嘴口喷出，并被鞘液包绕形成细胞液柱。这种同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态。鞘液和样品流组成一个圆形的流束，一起自喷嘴的圆形宝石孔喷射出来，进入流动室，与水平方向的激光光束垂直相交，该区称为测量区。利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区，被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。细胞发出的荧光信号和散射光信号，同时被荧光光电倍增管接收，被积分放大反转换为电子信号，再经过信号放大、加工处理后存储于计算机中，进而利用相关软件进行多参数统计分析，从而实现了细胞的定量分析。

三、流式细胞仪的细胞分离原理 

流式细胞仪对细胞的分选是通过流束形成含有细胞的带电液滴来实现的。在具分选功能的流式细胞仪流动室的喷嘴上装备有一个超声振荡压晶体片，这个振荡装置可将自喷嘴射出的液束破碎成千万个小滴，流动的细胞同时也就被分散在这些小水滴中。这时给流束一个电脉冲信号，使小水滴就全部带上电荷。当带有不同电荷的细胞液流经一对带正、负几千伏恒定静电电场的偏转板时，带电的小水滴就根据自身所带的电荷性质产生偏转，落入各自的收集容器中，不带电荷的水滴就进入中间的废液容器中，从而实现了细胞的分选。

四、流式细胞仪常用的几种检测方法（简略）

1．测定用乙醇固定的DNA的含量。

2．细胞凋亡检测及相关分子检测。

3．用流式细胞术进行DNA周期分析。

4．免疫荧光标记法。

五、流式细胞术中的几点注意事项：

1．对照组的设置：

在流式细胞术中所测得的量都是相对值，不是绝对值。如需知道绝对值时必须设置对照组样品。

 2．几点建议：

（1）在实验过程中，在保证实验的科学性和准确性的基础上，应尽量减少实验工序和过程。由于间接标记法的工序多，实验过程长，如再加之操作的不熟练，细胞更容易丢失和受损，而造成实验结果的误差。因此，在条件允许的范围内，建议尽量做直接标记法而不去做间接标记法，以保证实验的真实性和准确性。

（2）建议送检细胞一定要足够量，一般要求1×106个细胞。不要过少。因为，如细胞太少检测时样本流量相对会增大从而影响变异系数，结果也不可信。细胞量也不宜过多，因细胞量太多加入的抗体或染料相对不足，结果也由此受影响。