冰冻蚀刻（freeze-etching）技术得到的细胞膜结构图

今天听了三节课，教学内容都是细胞膜，三位老师都提到了冰冻蚀刻技术在研究细胞膜中的作用，而且都强调了技术对科学发展的重要性。我对这种技术不熟悉，有必要对这门技术的理论进行学习。从文字上来看，冰冻可以理解，那么什么是蚀刻呢？

一、简介

冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。是研究生物膜结构的重要方法之一。是电镜样品的一种制备技术，以显示细胞、组织微细结构科的立体构像。

细胞膜的双层类脂质层被劈分开后，其外层的内表面称胞质外面或E面（extracellular face，E-face）；其内层的外表面称胞质面或P面（plasllllc face， P-face）；在P面常可见许多直径6～9nm的膜内粒子，而E面则较少。一般认为腹内粒子是细胞膜和细胞内膜相结构中的镶嵌蛋白质粒子的图像，膜内粒子的数量与分布随膜的功能状态而变化。因此，可应用冷冻蚀刻复型求研究膜结构与功能的关系。

二、样品制备步骤如下：

1．冷冻

先把组织浸入含有20％～30的甘油生理盐水的冷冻保护剂中，以防止冰晶形成和提高冷冻速度，然后把组织放入液氮（-196℃) 内快速冻结。

2．断裂

在低温真空内，把冻结的组织用钢刀劈开，断裂面常为组织、细胞的薄弱部位，如膜的双层类脂质分子的疏水极之间，余下部分的表面要观察的部位。

3．蚀刻

在真空内将温度回升到-100℃，使断裂面的冰升华，形成凹凸不平的形态，即暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。

4．复型

在断裂面以45°角喷镀一层铂膜，以增加图像的反差和立体感，再喷镀一层碳膜以加固铂膜，加强反差和强度。然后用次氯酸钠等腐蚀液除去组织，把碳和铂的膜剥下来，捞取复型膜在透射电镜下观察。复膜（replica）显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。

酵母菌内部结构