冷冻电镜

生物技术的发展是生物科学发展的保障，生物技术的发展推动了生物科学的发展。一直以来，研究蛋白质结构有三种主要方法：X射线晶体衍射、核磁共振以及单颗粒冷冻电子显微镜（冷冻电镜）。

施一公说：“如果没有冷冻电镜技术，就完全不可能得到剪接体近原子水平的分辨率。”那么，什么是冷冻电镜技术？

冷冻电子显微镜技术（cryoelectron microscopy）是从20世纪70年代提出的，经过近10年的努力，在80年代趋于成熟。它的研究对象非常广泛，包括病毒、膜蛋白、肌丝、蛋白质核苷酸复合体、亚细胞器等等。利用冷冻电镜技术解析的生物大分子原子结构模型。随着这项技术的进步，我们不需要再辛辛苦苦地预测蛋白质的构象，只要拍一张“照片”就能知道蛋白质乃至蛋白质复合体相对真实的结构。

一、冷冻电镜技术的优越性

1．研究范围更广

冷冻电子显微镜技术所研究的生物样品既可以是具有二维晶体结构的，也可以是非晶体的；而且对于样品的分子量没有限制。因此，大大突破了X－射线晶体学只能研究三维晶体样品和核磁共振波谱学只能研究小分子量（小于100KDa）样品的限制。

2．接近样品的生活状态

生物样品是通过快速冷冻的方法进行固定的，克服了因化学固定、染色、金属镀膜等过程对样品构象的影响，更加接近样品的生活状态。

早期，冷冻电子显微镜都具备自动图像采集系统。CCD（charged-couple device）照相机能快速、动态的记录电子衍射图，但由于像素的限制，其分辨率不如照相胶片。CCD和照相胶片所记录的是生物样品空间结构的二维投影，利用各种计算机软件程序包，可以从电镜的二维图像重构样品的三维结构，即三维重构。

在过去两年里，冷冻电镜技术取得了革命性的进展，一方面是它的照相机技术，一方面是其软件分析的图像处理技术，尤其是前者的进步大幅提高了冷冻电镜的解析能力。现已开发出许多软件程序包可供计算机处理使用，大大方便了生物样品的结构重构。

二、冷冻电镜技术的操作过程

1．样品准备

用于冷冻电镜研究的生物大分子样品必须非常纯净。生物样品是在高真空的条件下成像的，所以样品的制备既要能够保持本身的结构，又能抗脱水、电子辐射。一种方法是通过快速冷冻使含水样品中的水处于玻璃态，也就是在亲水的支持膜上将含水样品包埋在一层较样品略高的薄冰内。

该方法有两个关键步骤：一是将样品在载网上形成一薄层水膜；二是将第一步获得的含水薄膜样品快速冷冻。在多数情况下，用手工将载网迅速浸入液氮内可使水冷冻成为玻璃态。其优点在于将样品保持在接近“生活”状态，不会因脱水而变形；减少辐射损伤；而且通过快速冷冻捕捉不同状态下的分子结构信息，了解分子功能循环中的构象变化。另一种方法是通过喷雾冷冻装置（spray-freezing equipment），利用结合底物混合冰冻技术(spray-freezing)，可以把两种溶液（如受体和配体）在极短的时间内混合起来 (ms量级)，然后快速冷冻，将其固定在某种反应中间状态，这样能对生物大分子在结合底物时或其他生化反应中的快速的结构变化进行测定，深入了解生物大分子的功能。 

2．数据采集

冷冻的样品通过专门的设备——冷冻输送器转移到电镜的样品室。在照相之前，必须观察样品中的水是否处于玻璃态，如果不是则应重新制备样品。由于生物样品对高能电子的辐射敏感，照相时必须使用最小曝光技术（minimal exposure technic）。要得到高分辨率的电镜图像，照相时累积的电子剂量不能超过临界剂量1000到2000e-nm-2；中等分辨率的电镜图像图像不能超过临界剂量 10000e-nm-2。 

3．图像处理和三维重构

数据处理的最终目的是为了获得生物样品的三维质量密度图。由于冷冻电镜获得图像信躁比低，结构信息常常淹没在躁声中而难辨认。只有通过大量拍摄生物样品的同一个图像，然后用某种方法加以平均来消除躁声。由二维图像推知三维结构的方法即三维重构。其理论原理是中心截面定理：即一个函数沿某方向投影函数的傅里叶变换等于此函数的傅里叶变换通过原点且垂直此投影方向的截面函数。

对所有样品都有三个基本的任务解决：第一，必须得到不同的样品图像；第二，计算确定样品方向和中心并不断优化；第三，无论在傅立叶空间还是真实空间，图像的移位必须加以计算校正，以使样品所有的图像有共同的原点。

基于以上三点，科学家建立了三种解析生物大分子的基本方法，一是电子晶体学，利用电子与晶体的相互作用研究生物大分子的结构性；二是单粒子法，根据大量不同取向的相同颗粒的电子显微图像，重构生物大分子的结构性；三是电子断层学，根据样品一系列不同的倾斜角度下的多个电子显微象进行三维重构。

附：利用冷冻电镜技术对核孔复合体的研究

核孔复合体（Nuclear Pore Complexes, NPCs），生物体内最复杂的蛋白质复合体之一，它由多达三十多种不同的蛋白质共同构建而成，依赖传统技术显然无法得到它的准确构象。不过通过冷冻电镜技术，研究人员成功还原了该复合体的精细结构。

 核孔复合体不同角度的影像