教学问题：教材上，DNA连接酶能催化具有粘性末端DNA分子的连接形成磷酸二酯键，能不催化平末端呢？

    （嘉兴二模试题）某种线性 DNA 含有限制性核酸内切酶 EcoRⅠ的 1 个酶切位点。该 DNA 样品（甲）经 EcoRⅠ酶切后，在 DNA 连接酶催化下形成产物乙（如图） 。则反应液中产物乙共有

    A．1 种           B．2 种          C．3 种       D．4 种

分析：此题和得分率只有28.3%,是选择题中最低的，说明学生在这方面还有欠缺。上述试题由于讲清楚是限制性核酸内切酶 EcoRⅠ，所以不会催化平末端的连接。

     DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO₄与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的（T4DNA连接酶除外），而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。

常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNA连接酶和来自噬菌体的T4DNA连接酶。二者的作用机理类似。

1．大肠杆菌的DNA连接酶

DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。

另外，NH4Cl可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶则无效。

2．T4DNA连接酶作用机制：

（1）T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶－AMP复合物。

（2）酶－AMP复合物结合到具有5’－磷酸基和3’－羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。

（3）产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。

分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。T4 DNA 连接酶能催化双链DNA上相邻的3ˊ羟基和5ˊ磷酸末断形成磷酸二脂键。

T4DNA连接酶连接要求和结果

 T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平末端。