转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台

在科研界的江湖中，流传着两大神器——Graphad和 ImageJ，堪称数据图像分析处理的“倚天剑”和“屠龙刀”。确实，它俩一经问世，就翻着花样包装处理着实验结果（原数据及图片），使其从屌丝瞬间逆袭为高富帅，这才能荣登高大上的期刊杂志。现如今，已鲜有软件能夺其锋芒了。

尤其就ImageJ（官网：https://imagej.nih.gov/ij/ , 不受电脑系统限制）这个图像分析大杀器，WB灰度定量、细胞计数等完全不在话下，傻瓜式操作可简单粗暴对图像进行抽丝剥茧般的分析，让实验结果所暗藏的规律清晰明了地呈现你的面前。

然而，这还仅仅只是ImageJ小试牛刀，不少潜能还隐藏在深海之下。最近，ImageJ再次按捺不住一腔热血，剑芒所指，誓要把细胞划痕实验以及细胞共定位收入囊下。各位科研志士们，还不速速习来，为自己苦心撰写论文再添一抹亮色。

细胞划痕实验分析

再说这细胞划痕实验（Wound Healing），它在细胞迁移/肿瘤侵袭方面确是一把好手。

在人为的给铺板的单层细胞划开一个空白无细胞地带后，划痕边缘的细胞便会努力迁移并逐渐覆盖空白区域来使划痕愈合，在一定程度上模拟了体内细胞迁移过程。

因而只需统计划痕面积（Scratch Area）随着时间的变化率以及伤口愈合百分比（Wound healing percentage），即可对细胞的侵袭性了如指掌。

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/5b47610038d640b49c18e94dd6cf1818.jpeg

A549划痕实验

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/491b95a99d334bfe8c780e5f787212c1.jpeg

ImageJ分析细胞划痕面积

那么如何在ImageJ中实现上图划痕面积和伤口愈合百分比的分析呢？且小编娓娓道来。

细胞共定位

Step1

打开ImageJ软件，其界面如下：

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/2968ee99f17948418adc454d84442d7f.png

File，Open，选择待分析图片（A549），界面如下：

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/69bafdd6a80d4a1aa58ed816fa5739d6.jpeg

Step2

增强对比：Process，Enhance Contrast，出现如界面：

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/f58c38493d2142d4bd289f27bbe0532c.png

勾上Normalize，Saturated pixels：0.3%，点击OK，效果如下：

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/c24390de9f644a8698767587d1888958.jpeg

Process，Smooth（平滑），效果如下：

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/9514f8869d2b4e6c92952aa56d7f4d81.jpeg

Process，Find Edges（寻找边缘），效果如下：

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/b4a71eb812b745ae9e0b3ece89676520.jpeg

Step3

Image，Adjust，Threshold，阈值选定，选中为红色，调节阈值为0—20。点击Apply。

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/49ef1e94a1204cae8d887fd93a49c687.jpeg

效果如下：

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/edcac34fd7334a82ae730744cc87dc64.png

Step4

选择魔棒工具，魔棒工具位于下图右下角：

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/067dfaebc6044cdf8d59199739c1290f.png

点击黑色的划痕部分，效果如下：

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/3887ba9e4b464dfc9b8836eae6ab2ed7.png

点击Analyze，Measure，结果如下，划痕面积Area为43328平方像素。根据最开始的划痕面积，跟某一时间愈合的那一部分面积（最开始面积-某时间点的面积）与最初面积的比值即可得到伤口愈合的百分比。

由此我们得到了划痕面积（Scratch Area）随着时间的变化、伤口愈合百分比（Wound healing percentage），进行后续统计分析即可。

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/d9f1de6a49104c5ca2110f16a04b95c2.png

Step5

将划痕面积轮廓添加到原图片（见下图），如何实现？

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/1217d99d1dff4321ae857c9cd5f85c26.jpeg

Analyze，Tools，ROI Manager，出现以下界面：

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/bf72b1f9de184f3494e6125143243bd5.png

将魔棒选中的ROI添加添加进ROI Manager，点击Add，选择右下方的Show All和Labels。

重新打开A549图片原图，点击Image，Overlay，From ROI Manager，得到如下界面：

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/9c62885405994aef8368ce0f12221f2a.jpeg

PS：关于面积单位，如果不进行标尺校正，得到的长度单位为pixel像素，面积单位为平方像素pixel2。

Step2

上图的左上角可以看见图片的大小为347x236 pixels，即A549图片未进行标尺校正。如何进行标尺校正：

打开一张带有标尺的图片，如下图（标尺见右下角）：

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/c0ad4fdb086b4c12991fb36904b5626a.jpeg

选择直线工具：

沿着标尺画一条直线，如下图：

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/0596a6f4566049e2a0b543c431b3f263.jpeg

点击Analyze，Set Scale

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/62ddbb90fd514bb6bb4df89761cb3ade.png

点击Click to Remove Scale，在Known distance下填入已知的长度50μm，Unit of length填入对应单位，选择Global为对之后打开的图片都有效，否则只对当前图片有效。

点击OK

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/0b909cba4669488db9f7aea7073e1ef1.png

此时图片左上角的图片大小长和宽变为了微米，如下图：

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/beeca4a021e84a8da5be840297101dad.jpeg

若此时再进行面积或长度的计算，单位就是已经校准的单位了。

细胞共定位

Step1

File , Open打开想要分析的两张荧光图片。如下图

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/a303abe9e688446380ce1e623536f9d6.jpeg

Step2

将两幅图片变成图像栈，image， stacks ， images to stack，弹出以下界面：

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/1829bae4bf2b4ea8b633cafa267cb67e.png

点击OK,即可通过滚动条在同一个图像栈查看两幅图片。

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/4c0e3c57e1144a228b6210720f361b71.jpeg

Step3

选择直线工具：，在图像栈中的一幅图片中的目标区域画一条直线，我们发现两幅图都会出现相同的直线。

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/180ccf43624541b09155c70133f64bd2.png

Step4

Analyze菜单下，点击Plot Profile，可弹出一个关于以线起点到终点为距离的X轴以及相应的灰度值的窗口。图像栈中每一幅图片都有对应结果，当滚动滚动条转换不同图片的时候，点击“live”，结果就会弹出来。

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/bb88afd7459b42a2a0fcad89d0e75077.jpeg

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/d773debdfe3b4e1c9e31bdbcc7eb7d7c.jpeg

图像栈中每幅图对应的距离与灰度值二维的结果图

点击“list”按钮，可以弹出具体X、Y数值的结果窗口，也可以点击“Save”按钮，保存以excel文件的数据。

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/1cc0ee2187f74b78bce2fc188a36145a.png

分别点击“list”，得到相应的X， Y轴数据

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/492bf9eb3736413f987fc53c667ba1a5.png

点击Save保存excel数据

可以利用excel作图，使图形更加美观（这里没有具体调节图形，只调节个别细节，excel作图不再赘述，见下图）。图中，我们可以看出代表red，blue两种染料有共定位的现象。

http://5b0988e595225.cdn.sohucs.com/images/20171010/5a8e2d58d37744c3a414c61c80d7b057.png

excel对结果的作图