小鼠淋巴细胞白血病细胞培养过程中需要注意哪些事项？

小鼠淋巴细胞白血病细胞多为悬浮生长特性，其培养过程的注意事项需围绕无菌操作、细胞密度控制、培养条件维持、污染防控等核心环节展开，具体如下：

无菌操作规范

实验前需对超净工作台进行 30 分钟以上紫外消毒，操作时佩戴无菌手套、口罩，避免手部直接接触细胞及培养基。

所有耗材（离心管、移液管、培养瓶）需经高压灭菌或无菌包装，培养基、血清、细胞因子等需用 0.22 μm 滤膜过滤除菌。

操作过程中，培养瓶/皿开口需始终朝向酒精灯火焰，减少空气微生物污染风险。

细胞密度与传代控制

接种密度：复苏或传代时，细胞接种密度需控制在 1×10 5∼5×105cells/mL，密度过低易导致细胞生长停滞，过高则会因营养不足、代谢废物堆积引发细胞凋亡。

传代时机：当细胞密度达到 2×106∼3×106cells/mL时（通常为培养 2~3 天），需及时传代。悬浮细胞无需胰酶消化，直接吸取细胞悬液，按 1:3~1:5 的比例加入新鲜培养基混匀即可。

吹打方式：传代或换液时，需用移液管轻柔吹打细胞悬液，避免用力过猛导致细胞破裂；对于易聚团的细胞系，可适当增加吹打次数，但需控制力度。

培养条件精准维持

培养基选择：常规使用含 10%~15% 胎牛血清（FBS）的 RPMI-1640 培养基；M-NFS-60 细胞需额外添加 10 ng/mL IL-3 或 M-CSF 才能正常生长，需注意细胞因子的活性与添加时机。

温湿度与气体环境：培养箱需稳定维持 37、5% CO、饱和湿度，定期检查 CO 浓度和水箱水位，避免因温度波动或湿度不足导致细胞生长异常。

换液频率：每 2~3 天更换一次新鲜培养基，换液时可离心（1000 rpm，5 分钟）收集细胞，弃去上清旧培养基，再重悬于新鲜培养基中，减少代谢废物对细胞的影响。

污染防控与监测

细菌/真菌污染监测：每日观察细胞状态，若培养基出现浑浊、变黄速度异常，或出现白色/黄色絮状沉淀、菌丝，提示污染，需立即丢弃污染细胞，避免交叉污染。

支原体污染防控：支原体污染无明显肉眼特征，但会导致细胞生长缓慢、形态异常，需定期（每 1~2 周）用支原体检测试剂盒筛查；若检测阳性，可使用支原体清除剂处理，或直接丢弃污染细胞重新复苏。

交叉污染预防：不同细胞系需分开操作，避免共用移液管、培养基；实验结束后，超净工作台需用 75% 酒精擦拭消毒。

冻存与复苏注意事项

冻存：冻存液为 90% FBS + 10% DMSO，细胞密度调整为 1×107cells/mL，采用梯度降温法（4 30 分钟 → -20 1 小时 → -80 过夜 → 液氮长期保存），避免 DMSO 对细胞的损伤。

复苏：从液氮中取出冻存管后，需迅速放入 37 水浴锅快速解冻（1~2 分钟），离心去除冻存液（DMSO 残留会杀伤细胞），再重悬于新鲜培养基中培养。

细胞状态评估

定期用显微镜观察细胞形态，健康的小鼠淋巴细胞白血病细胞呈圆形、透亮、大小均一，无明显颗粒；若细胞出现皱缩、变暗、颗粒增多，提示细胞状态不佳，需及时调整培养条件或传代。

可通过台盼蓝染色法检测细胞活力，活力应维持在 90% 以上，若活力低于 80%，需分析原因（如污染、营养不足、传代过度等）。

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