少突胶质前体细胞的培养方法及常见问题与解决方案！

 

少突胶质前体细胞（OPCs）的培养方法主要分为原代分离培养和细胞系培养两类，其中原代培养因能更真实模拟体内细胞特性，在研究中应用更广泛，核心是通过分离、纯化获得高纯度 OPCs 并维持其增殖或诱导分化。

 

一、核心培养类型：原代培养 vs 细胞系培养

 

两类方法的适用场景和操作难度差异较大，可根据研究需求选择：

 

培养类型      核心来源     优势    劣势     适用场景

 

原代培养  新生大鼠/小鼠的大脑皮层、视神经或脊髓  细胞功能接近体内状态，结果更可靠  操作复杂、周期长、纯度难控制，批次差异大  机制研究、药物筛选、分化功能验证

 

细胞系培养  永生化细胞系  操作简单、增殖快、纯度高、批次稳定  细胞特性经永生化后可能发生改变，与体内状态有差异  初步实验、毒性检测、快速获取大量细胞

 

二、原代培养（新生大鼠为例）：关键步骤与操作要点

 

原代培养的核心流程是“组织分离→细胞消化→纯化→培养与分化诱导”，每一步均需严格控制无菌和细胞活性。

 

1、实验准备：材料与试剂

 

动物材料：新生 1-3 天（P1-P3）的 SD 大鼠或 Wistar 大鼠（新生鼠 OPCs 增殖能力强，易分离）。

 

核心试剂：

 

基础培养基：DMEM/F12（1:1）培养基（含葡萄糖、谷氨酰胺）；

 

消化液：0.25% 胰蛋白酶 - EDTA（用于分解组织间质，释放单细胞）；

 

终止液：含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM/F12（中和胰酶活性，避免损伤细胞）；

 

培养添加剂：碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板源性生长因子 - AA（PDGF-AA，维持 OPCs 增殖并抑制分化）、胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒（ITS，提供营养）、青霉素 - 链霉素（双抗，防污染）；

 

纯化试剂：免疫磁珠（针对 NG2 或 A2B5 抗原，用于去除杂细胞）或差速贴壁法（利用 OPCs 贴壁慢的特性分离）。

 

器材：超净工作台、CO培养箱（37，5% CO）、解剖显微镜、离心管、培养皿、移液枪、无菌解剖器械（剪刀、镊子、解剖针）。

 

2、具体操作步骤（分阶段）

 

阶段 1：组织分离与单细胞悬液制备

 

动物处死与脑组织获取：新生大鼠用 75% 酒精消毒后断头，在解剖显微镜下快速取出大脑，剥离脑膜和血管，分离大脑皮层（或视神经、脊髓，根据需求选择），用预冷的 DMEM/F12 冲洗 2-3 次，去除血迹。

 

组织剪碎与消化：将脑组织剪切成 1mm³ 左右的小块，加入 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA，37孵育 10-15 分钟（每隔 5 分钟轻轻吹打 1 次，避免组织结块）。

 

终止消化与过滤：加入等量终止液（含 10% FBS 的 DMEM/F12）终止消化，用 100 目细胞筛过滤细胞悬液，去除未消化的组织块，收集滤液。

 

离心获取单细胞：滤液在 1000rpm 下离心 5 分钟，弃上清，用含双抗和 ITS 的 DMEM/F12 重悬细胞，计数后备用（活细胞率需≥90%）。

 

阶段 2：细胞纯化（关键：去除星形胶质细胞等杂细胞）

 

原代分离的细胞中会混杂星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞，需通过以下方法纯化 OPCs：

 

方法 1：差速贴壁法（简单、低成本）原理：星形胶质细胞贴壁快（30 分钟 - 1 小时），OPCs 贴壁慢。操作：将单细胞悬液接种到未包被的培养皿中，37孵育 1 小时后，轻轻收集上清液（含未贴壁的 OPCs），离心后重悬，接种到新的培养皿中，可重复 1-2 次提高纯度。

 

方法 2：免疫磁珠分选法（高效、高纯度）原理：利用 OPCs 表面特异性抗原与偶联抗体的磁珠结合，通过磁场分离杂细胞。操作：按试剂盒说明书，将细胞与抗 NG2/A2B5 磁珠孵育 20 分钟，用缓冲液洗涤后，通过磁柱，吸附在磁柱上的即为 OPCs，洗脱后离心重悬，纯度可达 90% 以上。

 

三、细胞系培养（以 OLN-93 细胞系为例）

 

操作远简单于原代培养，适合快速获取细胞：

 

复苏：从液氮中取出 OLN-93 细胞冻存管，37水浴快速融化（1 分钟内），加入 5mL 含 10% FBS 的 DMEM 培养基，1000rpm 离心 5 分钟，弃上清后重悬，接种到培养皿中。

 

传代：细胞密度达 80%-90% 时传代，用 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化 1-2 分钟，加入终止液后离心，按 1:3 比例接种到新培养皿，每 2-3 天换液 1 次。

 

分化诱导：更换为不含 FBS 的 DMEM 培养基，添加 1mM 环磷酸腺苷（cAMP）或 50nM T3，培养 3-5 天即可诱导分化。

 

四、培养关键注意事项

 

无菌控制：全程在超净工作台操作，试剂和器材需灭菌，动物组织取出后需彻底清洗，避免细菌或真菌污染（一旦污染，可加入 5μg/mL 两性霉素 B 应急，但会影响细胞活性）。

 

细胞活性保护：胰蛋白酶消化时间不可过长（原代细胞 10-15 分钟，细胞系 1-2 分钟），避免反复吹打损伤细胞；所有试剂需预温至 37，减少温度刺激。

 

纯度验证：培养后需通过免疫荧光染色验证 OPCs 纯度，常用标志物：

 

未分化 OPCs：A2B5、NG2、PDGFRα（血小板源性生长因子受体 α）；

 

成熟少突胶质细胞：MBP（髓鞘碱性蛋白）、PLP（蛋白脂质蛋白）。

 

批次一致性：原代培养需使用同批次、同日龄的新生鼠，避免因动物个体差异导致实验结果波动。

 

五、常见问题与解决方案

 

常见问题         可能原因          解决方案

 

细胞贴壁差  培养皿未包被（OPCs 需纤连蛋白/多聚赖氨酸包被）；消化过度  用 5μg/cm² 纤连蛋白包被培养皿；缩短胰酶消化时间

 

杂细胞过多  差速贴壁时间不足；免疫磁珠孵育时间不够  延长差速贴壁至 1.5 小时；按说明书调整磁珠孵育时间

 

分化效率低  分化培养基中 T3 浓度不足；细胞密度过高  调整 T3 浓度至 50-100nM；分化前将细胞密度控制在 50%-60%

 

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